Tesis Doctorado
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Browsing Tesis Doctorado by Author "Gutiérrez Reinoso, Miguel Ángel"
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Item Las vesículas extracelulares secretadas por embriones bovinos durante la etapa de blastulación y eclosión reflejan su competencia de desarrollo in vitro.(Universidad de Concepción, 2023) Gutiérrez Reinoso, Miguel Ángel; Rodríguez Álvarez, LleretnyEste trabajo se basó en el hecho de que los embriones producidos In vitro son menos competentes que los embriones generados In vivo. El objetivo de nuestra investigación fue determinar las características poblacionales y el perfil de miRNAs de EVs secretadas por embriones bovinos producidos In vitro e In vivo durante la etapa de blastulación y eclosión, y su relación con la calidad embrionaria. Para abordar este objetivo se planteó una pregunta biológica: ¿Las características (morfológicas y contenido de miARN) de las EVs son diferentes cuando los embriones morfológicamente competentes son producidos In vitro - In vivo o en estadios pre-implantatorios (blastulación vs eclosión)?. Para resolver esta pregunta se propusieron dos experimentos que se enfocaron en la caracterización poblacional de EVs y contenido de miARN contenidos en EVs secretadas por embriones In vitro e In vivo durante la blastulación (Exp 1) y la eclosión (Exp 2) por embriones calificados como competentes respecto a los criterios de competencia (Grados 1,2 IETS, para el día 7 y el diámetro o eclosión, para el día 11). Se produjeron mediante PIV e IVV embriones bovinos pre-implantatorios, y se distribuyeron en dos grupos de blastulación y eclosión (PIV5-7, IVV5-7; PIV7-9, IVV7-9). Se seleccionaron morfológicamente según los criterios de la IETS, (2010) las mórulas (Exp1: día 5) y blastocistos (Exp 2: día 7) colectados in vivo al dia 5 y dia 7 respectivamente; los embriones in vitro de dia 5 y 7 del cultivo grupal fueron cultivadas individualmente en medio SOFaa depletado hasta el dia 7 y 9 respectivamente. En general los embriones IVV e PIV se cultivaron hasta el día 11 en medio extendido desde sus estadios de 5-7 días y 7-9 días. El 88,3 % y el 43,05% de los embriones PIV e IVV alcanzaron el estadio de blastocisto a día 7. El desarrollo a día 11 fue significativamente mayor en los embriones producidos IVV (d7-9) (P˂0.05) respecto a los PIV. Los embriones IVV en general tuvieron una mayor tasa de eclosión, siendo >50 % respecto a los PIV. La cinética del desarrollo embrionario presento diferencias significativas entre los grupos de embriones asociadas tanto por el origen (In vitro-In vivo) como por la ventana de estudio (blastulación-eclosión). Al día 11 los embriones de la ventana 7-9 IVV fueron los de mayor diámetro (PIV 5-7: 381,93 ±97,48; IVV 5-7: 345,68 ± 107,26; PIV 7-9: 471,72 ± 77,24; y IVV 7-9: 508,69 ± 90,56 μm). Luego de este análisis se seleccionaron 133 medios de cultivos colectados de embriones calificados como competentes y se caracterizaron las poblaciones de Vesículas Extracelulares (EVs), definidas acorde a los tres criterios básicos recomendados por la Sociedad Internacional de Vesículas extracelulares (ISEV) para definir EVs: 1) presencia de marcadores de superficie específicos (Citometría), 2) morfología (Microscopia Electrónica de Transmisión-TEM), y 3) tamaño y concentración (Nano Tracking Analysis, NTA). Las EVs de medios de cultivo de embriones y del control positivo (EVs de suero fetal bovino) fueron positivas para los cuatro marcadores proteicos específicos de superficie de EVs analizados (CD9, CD63, CD81 y CD40). Mediante TEM se identificaron estructuras con morfología clásica de EVs, con un diámetro entre 100 y 500 nm, con forma redondeada o de copa y presencia de una bicapa; además no se observaron diferencias morfológicas entre las EVs de los embriones de los diferentes grupos experimentales. Se caracterizó la población de EVs de acuerdo con su tamaño (pequeñas (<120 nm y grandes (>120 nm) y concentración. (NTA): al tamaño y concentración de EVs. Las variables de morfología del blastocisto y características morfológicas de las EVs fueron sometidas a análisis de componentes principales (ACP) para discriminar los grupos de embriones. El análisis estadístico se realizó con el programa SAS versión del sistema ocho para Windows y programa IBM SPSS Statistics versión 19. Se detectaron poblaciones de EVs en el rango de 25-620 nm, pero con mayor concentración en el rango de pequeñas vesículas (menor de 200 nm). Se observaron dos poblaciones de EVs: vesículas grandes (>120 nm) y vesículas pequeñas (≤120 nm). Para el análisis del contenido de microARNs las muestras se obtuvieron aleatoriamente de cada réplica experimental que contenía EVs de 10 embriones: 6 réplicas del grupo PIV5-7, 3 réplicas IVV5-7, 3 réplicas PIV7-9 y 3 réplicas IVV7-9. Se realizó la extracción y análisis de calidad del ARN total por réplica. El RIN (“RNA Integrity Number”) fue mayor a 7, considerado aceptable para el análisis de secuenciación. El programa Fastp detectó lecturas de 75 ± 1 pares de bases (Paired End) y con un inserto de 149 pares de bases las cuales fueron mapeadas contra el genoma disponible en Mirbase versión 21. Se realizó un análisis de componentes principales (ACP) para determinar la variabilidad de los conteos entre las réplicas de cada grupo experimental: Se observó mayor separación inter-grupal entre los grupos IVV e PIV (blastulación) y menor separación inter-grupal entre los grupos IVV e PIV (eclosión). Se identificaron 122 miARNs con un CPM (conteos por millón) sobre 5; y se detectaron 74 miARNs comunes que están presentes en todos grupos experimentales. El análisis de expresión diferencial de miRNAs en las EVs en función del origen embrionario muestra 32 y 65 miARNs mayormente representados en las EVs secretadas durante la blastulación de embriones IVV e PIV respectivamente y 5 miARNs diferencialmente representados en las EVs de embriones IVV. Respecto al contenido de miARNs en las EVs, hubo una disminución en el contenido de miARNs mayormente representados a medida que avanza el desarrollo embrionario, tanto para los in vitro como In vivo. En el estadio de eclosión se identificó un miARN exclusivo de las EVs de los embriones IVV y 18 exclusivos en las EVs de los embriones PIV, mientras que 2 miARNs están igualmente representados en las EVs de los embriones de ambos orígenes. Finalmente se realizó un análisis de ontología para caracterizar la función molecular. Los miARNs sobrexpresados de las EVs secretadas durante la eclosión por embriones PIV afectan un mayor número de funciones biológicas que los sobreexpresados en EVs de embriones IVV, incluyendo 9 funciones exclusivamente afectadas. En conclusión, en este trabajo se demostró que el origen embrionario (In vivo vs In vitro) y su etapa de desarrollo (blastulación y eclosión) tienen un efecto sobre las características poblacionales (tamaño promedio, concentración y contenido de miARNs) de vesículas extracelulares secretadas por embriones bovinos. Por tanto, una mayor secreción de EVS y un mayor número de microARNs diferencialmente expresados podrían estar relacionados con la competencia embrionaria.