Tesis Doctorado
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Browsing Tesis Doctorado by Author "Melo Báez, Bárbara Belén"
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Item Caracterización morfológica y molecular de vesículas extracelulares secretadas por embriones bovinos pre- implantatorios durante el periodo de compactación(Universidad de Concepción, 2023) Melo Báez, Bárbara Belén; Rodríguez Álvarez, LlerethyLas vesículas extracelulares (EVs) son secretadas por diferentes tipos celulares y cargan con diferentes moléculas como ARNm, pequeños ARNs, proteínas, lípidos, e incluso ADN, por lo que se ha propuesto utilizarlas como biomarcadores y agentes terapeúticos. Además, se han descrito como mecanismo de comunicación celular debido a su habilidad de transferir aquellas moléculas a células receptoras. Las EVs están involucradas en diversos procesos fisiológicos reproductivos como desarrollo de gametos y comunicación embrio-materna, incluso previo a la señalización molecular del reconocimiento de la gestación mediado por IFN-tau. Las características de las EVs como concentración, tamaño, distribución y contenido podrían reflejar la calidad embrionaria, y ser útiles para la predicción de la competencia embrionaria en embriones producidos in vitro. Este estudio tuvo como objetivo caracterizar las EVs secretadas por embriones bovinos producidos in vitro con diferente competencia embrionaria durante la activación del genoma embrionario, y la búsqueda de miRNAs asociados a EVs que permitan la selección temprana de embriones bovinos, además de identificar si estos miRNAs reflejan el estado molecular del embrión. En el primer experimento se colectaron las EVs producidas por embriones cultivados individualmente desde la activación del genoma embrionario (día 3.5 post-IVF) hasta la compactación embrionaria (día 5 post-IVF), y se clasificaron según la capacidad de alcanzar el estadío de blastocisto al día 7. Las EVs expresaron marcadores específicos de superficie como CD9, CD81, CD63 y CD40 en ambos grupos experimentales, y presentaron redondeada con bicapa lipídica. Los embriones que se bloquearon al día 3.5 post-IVF (G1) secretaron mayor concentración de EVs, y éstas tenían un tamaño superior, en comparación a las EVs secretadas por embriones que continuaron su desarrollo (G2). Se identificaron 95 miRNAs en las muestras y 8 miRNAs se expresaron diferencialmente entre los grupos experimentales (G1 contra G2), donde bta-miR-103, bta-miR-100, bra-miR-502a y bta-miR-1 se encontraron sobreexpresados en las EVs secretadas por embriones bloqueados (G1), mientras que bta-miR-92a, bta-miR-140, bta-miR-2285av y bta-miR-222 se encontraron sobreexpresados en el G2. Aquellos miRNAs sobre expresados se encuentran regulando vías de señalización importantes para el desarrollo embrionario como biosíntesis y metabolismo de ácidos grasos, degradación de lisina, gap junction y regulación de células madre. En el segundo experimento, se realizó biopsia en embriones bovinos de 8 células al día 3.5 post-IVF y se mantuvo en cultivo individual en medio depletado de EVs hasta el día 5. Se evaluó el set de miRNAs en las blastómeras colectadas al día 3,5 post-IVF, en el embrión resultante al día 5 post-IVF y en el medio de cultivo condicionado durante esta etapa de desarrollo. Se encontró mayor expresión de bta-miR-100, bta-miR-92a, bta-miR-222 en las blastómeras obtenidas mediante biopsia de embriones al día 3.5 post-IVF en relación con los embriones al día 5 (p<0.05). La expresión de bta-miR-100 y bta-miR-103 es mayor en los embriones bloqueados que los embriones competentes. Además, en el caso de bta-miR-100 y bta-miR-103 se sigue un patrón de expresión génica decendiente desde las blastómeras, hacia los embriones, tanto en los bloqueados como en los competentes (p<0.05). Con respecto a bta-miR-140, la mayor expresión se obtuvo en las EVs de los embriones que se bloquearon (p<0.05). En conclusión, los embriones secretan EVs, cuyas características morfológicas y moleculares dependen de su competencia y estadío de desarrollo. Al mismo tiempo, el embrión utiliza la secreción de EVs como un método de descarte de moléculas perjudiciales para intentar rescatar el desarrollo embrionario.