Tesis Doctorado

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Biotransformación de cetonas proquirales utilizando levaduras y hongos filamentosos.
(Universidad de Concepción., 2010) Silva Agredo, Javier; Alderete Triviños, Joel Bernabé
Las metodologías empleadas en síntesis asimétrica para la obtención de compuestos enantioméricamente puros han sido dirigidas especialmente a la utilización de procesos catalíticos químicos o biológicos. Particularmente, los alcoholes quirales pueden ser obtenidos por métodos biológicos mediante la utilización de microorganismos. Estas biotransformaciones se realizan bajo condiciones suaves de reacción y permiten la regeneración in vivo del cofactor necesario para la reducción por lo que son empleadas especialmente en las industrias farmacéutica y agroalimentaria las cuales requieren que los compuestos quirales posean una elevada pureza enantiomérica.
Diseño de compuestos con potencial actividad antitumoral en base al estudio bioinformático de la interacción tubulina-epotilona
(Universidad de Concepción., 2018) Navarrete Fuentes, Karen Roxana; Jiménez, Verónica; Alderete Triviños, Joel Bernabé
En esta tesis se propuso identificar nuevos agentes de asociación a tubulina con potencial actividad antitumoral a partir de la búsqueda de compuestos que imiten el mecanismo de acción de epotilonas, agentes antimitóticos actualmente utilizados en ensayos clínicos. Para ello se obtuvieron modelos de asociación de 20 complejos epotilona-tubulina mediante simulaciones de Dinámica Molecular. Estos modelos fueron validados con la información sobre la relación entre estructura y actividad disponible para dicha serie de derivados. Una vez identificados los residuos de tubulina e interacciones más relevantes en la asociación tubulina-epotilona se realizó Screening Virtual (SV) usando librerías de moléculas de la base de datos ZINC que fueron filtradas según criterios farmacológicos y estructurales. Entre los compuestos mejor evaluados del SV se seleccionaron 12 candidatos para realizar ensayos biológicos, testeando su actividad biológica a través de medidas de polimerización de tubulina in vitro, resultando tres de los compuestos ser agentes promotores de la polimerización de tubulina y por lo tanto potenciales nuevos compuestos antitumorales.
Diseño de nano-transportadores de fármacos dirigidos hacia la proteína e-selectina para su potencial utilización en tratamientos contra el cáncer.
(Universidad de Concepción., 2016) Barra Oliva, Pabla Andrea; Alderete Triviños, Joel Bernabé
En la actualidad, los aportes de la nano-tecnología han hecho posible el desarrollo de nuevos sistemas de detección y tratamiento para diversas enfermedades con mayor eficacia y especificidad. En particular, el desarrollo de nano-transportadores selectivos para el transporte y la liberación dirigida de fármacos, apunta a mejorar diversas limitaciones que presentan los tratamientos antineoplásicos convencionales, tales como; solubilidad, índice terapéutico y principalmente la limitada especificidad de los fármacos utilizados. Para dirigir de forma más selectiva los nano-transportadores al tejido tumoral se han buscado distintos receptores que se expresen preferentemente en la superficie de células tumorales. E-selectina, por ejemplo, es una proteína de adhesión molecular que se expresa en el endotelio vascular activado y cumple un rol importante en procesos inflamatorios y de metástasis celular, convirtiéndose en un blanco molecular de gran interés terapéutico. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral fue: diseñar, sintetizar y evaluar la citotoxicidad celular de un nuevo nano-transportador de fármacos dirigido hacia la proteína E-selectina. Para lograr este objetivo, se utilizó la técnica de Virtual Screening para realizar una exhaustiva búsqueda empleando una librería de más de quince millones de compuestos, lo cual permitió seleccionar diez compuestos con gran afinidad por la proteína. Además, con el fin de estudiar el modo de unión de los ligandos seleccionados en el sitio activo de la proteína y obtener las energías de interacción, se realizaron simulaciones de Dinámica Molecular (DM). La afinidad experimental de los ligandos por la E-selectina fue obtenida mediante Espectroscopia de Fluorescencia, con valores de Kd que oscilan desde 333 μM a 1 mM. Ensayos de Diferencia de Transferencia de Saturación y análisis de CORCEMA-ST, fueron realizados para corroborar el modelo de asociación del ligando seleccionado con la proteína E-selectina obtenido desde DM. Finalmente, el nano-transportador dirigido fue sintetizado, mediante la conjugación superficial del dendrímero PAMAM de cuarta generación con poli(etilenglicol) y el ligando que presentó la mayor afinidad por la proteína. Los análisis biológicos dieron cuenta de que el nano-transportador dirigido no presenta citotoxicidad hacia las células HEK en el rango de concentraciones estudiada. En conclusión, los promisorios resultados expuestos en esta Tesis Doctoral pueden ser empleados como punto de partida en el diseño de nuevos y poderosos transportadores dirigidos de fármacos.
Diseño de nuevos nanotransportadores bifuncionales basados en sistemas conjugados péptido-pamam-ptat con potencial aplicación en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
(Universidad de Concepción., 2021) Marrugo Agresott, Kelly Patricia; Campos Figueroa, Cristian Hugo Alberto; Alderete Triviños, Joel Bernabé
Hoy en día las enfermedades del SNC aún suponen un gran desafío para la industria farmacológica, debido a la baja tasa de penetración de la BHE que exhiben muchas de las drogas actualmente empleadas como tratamiento. En este sentido, el desarrollo de estructuras macromoleculares a través de la nanotecnología representa una alternativa para la entrega exitosa de fármacos a través de esta compleja membrana. En esta tesis doctoral se describe el diseño, síntesis, caracterización y ensayos biológicos de un nuevo nanotransportador bifuncional que tiene como base al dendrímero PAMAM de cuarta generación, el cual fue acetilado para disminuir su citotoxicidad intrínseca, posteriormente conjugado con el péptido penetrante de células pTAT (un vector de internalización celular), y a su vez con el péptido CIELFQAR, un ligando de gran afinidad por la proteína E-selectina. La primera etapa del trabajo de investigación consistió en la búsqueda de un péptido mutante de mayor afinidad por E-selectina a partir del péptido nativo IELLQAR mediante estudios de docking, DM y cálculos de energía libre por el método MM/GBSA. La afinidad experimental de los péptidos candidatos se realizó por la técnica MST, donde se validó la tendencia de unión por la proteína a través de los valores de Kd.La segunda etapa consistió en la síntesis del nuevo nanotransportador bifuncional, para el cual se eligió al péptido de mayor afinidad CIELFQAR. Asimismo, se sintetizó un nanotransportador control con el péptido CIELLQAR que sirvió para validar su internalización celular y su especificidad por Eselectina. Los nanotransportadores sintetizados presentaron baja toxicidad tanto en el modelo de células endoteliales (HUVEC/TERT2) como en el modelo de células de cáncer cerebral (T98G). Por otra parte, la internalización de AC50-pTAT CIELFQAR en ambas líneas celulares fue mediada selectivamente por el receptor E-selectina en comparación a AC50-pTAT-CIELLQAR y los dendrímeros precursores AC50 y AC50-pTAT. En consecuencia, se reporta la obtención del nanotransportador bifuncional AC50-pTAT-CIELFQAR, el cual se perfila como una novedosa macromolécula dirigida hacia la BHE con potencial aplicación en el tratamiento de enfermedades del neurodegenerativas y cáncer cerebral.
Efecto de la modificación superficial de dendrímeros PAMAM en la cinética plasmática y formación de complejos con aplicación farmacológica.
(Universidad de Concepción., 2018) Díaz Gómez, Carola Fernanda; Alderete Triviños, Joel Bernabé; Yévenes Crisóstomo, Gonzalo Enrique
La aplicación de nanomateriales en biomedicina, a raíz de su gran capacidad para encapsular y transportar moléculas, ha permitido avanzar en el diagnóstico y tratamiento de diversas enfermedades. Patologías de alta complejidad como el cáncer, cuya terapia se encuentra limitada por las características de los fármacos utilizados, ven el uso de nanotrasportadores como una de las posibles estrategias para superar esta problemática. De los nanotransportadores generados, los dendrímeros poliamidoamina (PAMAM) se encuentran a la vanguardia de la investigación y sus propiedades han sido ampliamente reportadas; no obstante, la citotoxicidad asociada a sus aminas primarias superficiales y su falta de selectividad por el tejido patológico, demandan un perfeccionamiento de estos sistemas. Con el objetivo de potenciar las características positivas de los PAMAM y utilizarlos como nanotransportadores, estos fueron funcionalizados con polietilenglicol de 2000 Da y con ácido fólico (PAMAM-PEG y PAMAM-FA) y luego caracterizados estructuralmente por espectroscopía de resonancia magnética nuclear. Además, para conocer el efecto de la funcionalización superficial se estudió la viabilidad celular y en la cinética plasmática de PAMAM y los sistemas modificados. Finalmente, se formaron complejos supramoleculares con octreótido (OCT) y metotrexato (MTX) –moléculas antiproliferativas empleadas en el tratamiento del cáncer- para analizar si los nanotransportadores causan sinergia en el efecto intrínseco de los fármacos en cultivos celulares de líneas de cáncer. Los resultados de esta tesis revelaron que la funcionalización de dendrímeros PAMAM de cuarta generación modula no sólo su cinética plasmática, sino que además potencia el efecto antiproliferativo de octreótido y metotrexato a concentraciones experimentales muy bajas. PAMAM-FA y PAMAM-PEG fomentan este fenómeno tanto en cultivos celulares de HeLa como de PC12, pero el sistema pegilado es el que alcanza el efecto más pronunciado. PAMAM-PEG mostró la vida media plasmática más prolongada y los parámetros farmacocinéticos más auspiciosos para modular el transporte. Este antecedente, más la sinergia de la antiproliferación celular de OCT y MTX a causa de su interacción con el dendrímero pegilado, lo perfila como un nanomaterial potencial para avanzar hacia su aplicación clínica en la terapia contra el cáncer.
Estudio computacional sobre la formación de complejos de inclusión con huéspedes alifáticos y aromáticos en a- y ß-ciclodextrinas.
(Universidad de Concepción., 2006) Jiménez Curihual, Verónica Andrea; Alderete Triviños, Joel Bernabé
En el presente trabajo de tesis se ha estudiado la formación de complejos de inclusión con moléculas alifáticas y aromáticas, en α-ciclodextrina (ACD) y β-ciclodextrina (BCD), haciendo uso datos experimentales, técnicas estadísticas y cálculos computacionales semiempíricos (PM3) y ab initio (HF/STO-3G, HF/3-21G(d) y HF/6-31G(d)). A partir del estudio realizado se ha concluido que la formación de complejos de inclusión depende de una combinación de interacciones de van der Waals, electrostáticas, hidrofóbicas y de transferencia de carga. Al respecto, se ha determinado que la inclusión de moléculas aniónicas favorece los procesos de transferencia electrónica entre el huésped y la ciclodextrina. Adicionalmente, se ha establecido que los impedimentos estéricos juegan un rol preponderante en la estabilización de los complejos formados por ACD.
Estudio químico-computacional para la inhibición de la enzima ácido acetohidroxi sintasa, por una sulfonilurea.
(Universidad de Concepción., 2010) Jaña Villalobos, Gonzalo Alfredo; Alderete Triviños, Joel Bernabé
Las enzimas son macromoléculas involucradas en la catálisis y el control de la mayoría de los procesos de la vida. Por lo tanto, la comprensión de su naturaleza catalítica ha sido unos de los principales desafíos en bioquímica [1,2]. Aunque muchas incógnitas con respecto a la naturaleza de la catálisis enzimática han sido resueltas por medio de estudios bioquímicos y estructurales, el origen de su poder catalítico hasta ahora sigue sin ser comprendido a cabalidad, ya que la evidencia empírica sólo permite conocer aspectos generales de la catálisis enzimática, como por ejemplo, velocidades de reacción, efectos alostéricos, mecanismos de inhibición, etc.
Inmovilización de proteínas con actividad peroxidasa en nanoestructuras y sus aplicaciones sobre reacciones de Epoxidación de Olefinas.
(Universidad de Concepción., 2010) Águila Puentes, Sergio Andrés; Alderete Triviños, Joel Bernabé; Pecchi Sánchez, Gina
Las enzimas son ampliamente utilizadas para la obtención de compuestos intermediarios quirales, tales como los derivados epoxidados que son necesarios para la industria farmacéutica, perfumes y química fina, entre otras. En particular, las peroxidasas han sido empleadas en la obtención de epóxidos. Sin embargo la eficiencia de estas reacciones se ve severamente limitada ya que estas enzimas pierden su actividad durante la catálisis. En esta tesis se han explorado dos maneras de aumentar la actividad y estabilidad enzimática, la primera mediante el uso de variantes obtenidas a partir de mutaciones dirigidas y la segunda por medio de la inmovilización de las enzimas nativas en soportes inertes. El efecto de algunas mutaciones sobre la actividad peroxidasa en estireno fue estudiada en variantes de iso-1-citocromo c. Estudios de Dinámica Molecular han permitido racionalizar los resultados en términos de los cambios conformacionales asociados a las mutaciones. Además, se ha desarrollado un modelo estructural que permitió estudiar los posibles mecanismos de activación enzimática con H2O2 y la oxidación estireno. Los estudios de los mecanismos de activación y oxidación se realizaron a nivel químico-cuántico empleando el método semiempírico PM6. Los efectos de la inmovilización sobre la actividad catalítica y estabilidad de las enzimas fueron estudiados mediante la inmovilización de iso-1-citocromo c de S. cerevisiae y cloroperoxidasa de C. fumago en los soportes nanoestruturados MCM-41, SBA-15 y MCF y su reacción con los siguientes monoterpenos: R-limoneno, S-limoneno y R-carvona. Se observó que el grado de inmovilización en los soportes nanoestructurados depende del diámetro de poro y que hay un aumento de actividad debido a la inmovilización. También la inmovilización mejora la estabilidad de las enzimas frente al aumento de solvente orgánico en el medio de reacción.
Nanotubos de TiO2 reducido como potencial plataforma para fotoquimioterapia del cáncer.
(Universidad de Concepción, 2024) Vélez Peña, Estefanía; Campos Figueroa, Cristian Hugo Alberto; Alderete Triviños, Joel Bernabé
El cáncer es un conjunto de enfermedades que ha causado una alta tasa de mortalidad alrededor del mundo, por lo que es de vital importancia el desarrollo de diversas estrategias de tratamiento debido al gran impacto que tiene sobre la sociedad. En ese sentido, el uso de nanomateriales ha surgido como un enfoque prometedor para el desarrollo de sistemas con la capacidad de propiciar modalidades de tratamiento combinadas para mejorar la eficacia y superar limitaciones relacionadas a los tratamientos convencionales. Por lo anterior, en la presente tesis doctoral se prepararon nanotransportadores basados en dióxido de titanio (TiO2) sin reducir y reducido, funcionalizados superficialmente con los fotosensibilizadores Chlorin e6 (Ce6) y Toluidine Blue O (TBO), con capacidad de adsorber fármacos quimioterapeuticos con el propósito de combinar los efectos de la administración de fármacos, mediada por nanomateriales, y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), esenciales para la terapia fotodinámica (PDT–Photodynamic Therapy), como estrategias para inducir muerte de células cancerosas. La caracterización realizada en las diferentes etapas de preparación de los nanomateriales confirman la obtención de nanorods de TiO2 que tras ser sometidos al tratamiento térmico con NaBH4 dan lugar a nanorods de TiO2 negro (NRTN). Los sistemas que poseen fotosensibilizadores unidos covalentemente a su superficie evidenciaron la generación de ROS, específicamente 1O2 y HO•, bajo irradiación con luz LED visible, las cuales fueron detectadas a través de un método fluorimétrico empleando hidroxifenilfloresceína (HPF) y Sensor de Oxígeno Singlete Verde (SOSG), como sensores de HO• y 1O2, respectivamente. Los experimentos de viabilidad celular in vitro con células HeLa mostraron que los nanomateriales preparados exhiben actividad fotodinámica cuando se irradian con luz LED visible (150 W m-2), y no son citotóxicos en oscuridad bajo las condiciones evaluadas. Además, los experimentos de encapsulación de doxorrubicina (DOX), como fármaco quimioterapéutico modelo, demostraron que las nanoestructuras encapsulan eficazmente DOX y las formulaciones de nanomateriales/DOX muestran efectos quimiocitotóxicos en las células HeLa. Los experimentos combinados de quimio-fototoxicidad muestran efectos mejorados en cuanto a la reducción de la viabilidad de las células HeLa, indicando que los NRTN conjugados con fotosensibilizadores son plataformas prometedoras para su uso en terapia combinada inducida por irradiación de luz visible.
Reacciones de epoxidación de derivados del estireno catalizadas por cloroperoxidasa de Caldariomyces fumago inmovilizada en soportes nanoestructurados para el mejoramiento de su estabilidad operacional.
(Universidad de Concepción., 2015) Muñoz Guerrero, Fabio Alexander; Alderete Triviños, Joel Bernabé; Vásquez, Rafael
Las reacciones de epoxidación catalizadas por cloroperoxidasa (CPO) de Caldariomyces fumago se presentan como una aproximación biocatalítica interesante para la obtención de epóxidos. Sin embargo, su implementación a gran escala presenta dos limitaciones importantes: la baja solubilidad de sustratos hidrofóbicos en el medio acuoso donde se llevan a cabo estas reacciones, y la baja estabilidad operacional de la CPO frente a concentraciones catalíticas del peróxido de hidrógeno debido a su inactivación suicida. Para contrarrestar estas limitaciones se han desarrollado diferentes estrategias, como el uso de cosolvente orgánico en el medio de reacción, la dosificación del H2O2 y la inmovilización de enzimas. Por esta razón, en el presente trabajo se propuso mejorar la estabilidad operacional de la CPO en la biocatálisis de las reacciones de epoxidación del estireno y algunos derivados m-sustituidos, mediante su inmovilización en soportes nanoestructurados no magnéticos de sílice (MCF y MSU-F) y titania (anatasa y nanotubos), y en nanomateriales magnéticos de óxidos de hierro (nanopartículas y nanotubos). También se procedió al ajuste de algunas condiciones de la reacción relacionadas con el uso de un co-solvente orgánico y la dosificación de peróxido de hidrógeno. El establecimiento de los parámetros de operación evaluados permitió el mejoramiento de la eficiencia catalítica y de la estabilidad operacional de la enzima libre. Por otra parte, las preparaciones de CPO inmovilizada en materiales mesoporosos nanoestructurados no magnéticos presentaron un mejoramiento significativo de la eficiencia catalítica y de la estabilidad operacional con respecto a CPO libre. Los mejores resultados se obtuvieron con el sistema CPO/TiO2(NT) el cual presentó un número de recambio total (NRT) de 273040 utilizando 3-aminoestireno como sustrato, esto representó un aumento de 15 veces en la estabilidad operacional con respecto a la enzima libre. En cuanto a los biocatalizadores obtenidos con los soportes nanoestructurados magnéticos, la CPO presentó un leve incremento en la estabilidad operacional, mientras que las eficiencias catalíticas fueron similares o inferiores a las de la enzima libre.
Síntesis, simulación molecular y aplicación de nuevos dendrímeros en el transporte y liberación controlada de fármacos anticancerígenos.
(Universidad de Concepción., 2015) Barraza Ramírez, Luis Felipe; Alderete Triviños, Joel Bernabé
En esta tesis doctoral se trabajó en el diseño racional de un nuevo sistema transportador de fármacos anticancerígenos basado en dendrímeros PAMAM pegilados (PEG-PAMAM). Se emplearon simulaciones de dinámica molecular (DM) en conjunto con métodos espectroscópicos (RMN, IR, UV-VIS) para investigar el efecto de la ¨pegilación¨ de un dendrímero PAMAM-G4 sobre sus propiedades estructurales y cómo estas influyen en su capacidad de complejación con dos de los fármacos más empleados actualmente en el tratamiento del cáncer, como son 5 fluorouracilo (5FU) y metotrexato (MTX). Los resultados obtenidos a partir de las simulaciones de DM muestran fuertes dependencias en las estequiometrías de los complejos droga:dendrímero y sitios de interacción, con la naturaleza química de las drogas, sugiriendo que sólo la pegilación parcial del dendrímero ( 50%) representa una estrategia sintética adecuada para maximizar su capacidad de complejación, ya que altos grados de pegilación conllevan a una disminución en la cantidad de droga complejada internamente. Estos resultados fueron confirmados experimentalmente mediante experimentos 2D-NOESY y perfiles de solubilidad en disolución acuosa. A partir de estos últimos, se calcularon constantes de afinidad droga:dendrímero Kn:1 , cuyos valores sugieren que los complejos con MTX presentan una interacción fuerte y estable (Kn:1 104), mientras que los complejos con 5FU presentan una interacción débil e inestable (Kn:1 10). Se investigó también el efecto de la pegilación sobre la cinética de liberación de ambas drogas mediante el método de diálisis en equilibrio. Los resultados obtenidos muestran que tanto MTX como 5FU siguen una cinética de liberación de primer orden, lo que es indicativo de un mecanismo de liberación controlado por difusión. Por otro lado, los valores de las constantes cinéticas obtenidas sugieren que altos grados de pegilación retardan la fuga de MTX desde los nanotransportadores, mientras que para 5FU se observó el efecto contrario, lo que se atribuyó a que en sistemas con altos grados de pegilación cerca del 90% de las moléculas de 5FU se encuentran complejadas con las cadenas de PEG, desde donde son liberadas con facilidad. Finalmente, se evaluó si la conjugación de un dendrímero PEG-PAMAM con el éster del ácido N-succinimidil-6-maleimidohexanóico (MHA) permite obtener una liberación controlada de ambas drogas en condiciones de pH fisiológico (7.4) y una liberación acelerada en condiciones de pH similar a la existente en los espacios intersticiales de células cancerígenas (pH  5.0). Los resultados obtenidos no mostraron diferencias en los perfiles de liberación producto de la conjugación con MHA, sin embargo los resultados recopilados durante el desarrollo de esta tesis pueden ser útiles para diseñar nuevos y más eficientes sistemas para la administración de fármacos anticancerígenos basados en dendrímeros PAMAM.

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