Facultad de Ciencias Biológicas
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Browsing Facultad de Ciencias Biológicas by Author "Amigo Bastías, Roberto Antonio"
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Item Influencia de secuencias de ADN en procesos activos que determinan el posicionamiento nucleosomal.(Universidad de Concepción, 2023) Amigo Bastías, Roberto Antonio; Gutiérrez Contreras, José LeonardoLa posición de los nucleosomas tiene un gran impacto en procesos celulares que involucran interacción proteína-ADN, como es el caso de la replicación, reparación y transcripción. En Saccharomyces cerevisiae los promotores de genes se encuentran enriquecidos en secuencias homopoliméricas de ADN denominados tractos poli (dA:dT), las cuales se relacionan con la presencia de regiones libres de nucleosomas (NDRs). En otros organismos, como ratón y humano, la presencia de tractos poli (dA:dT) es menor y su distribución es más amplia; sin embargo, mantienen su capacidad de excluir nucleosomas, lo que podría significar que existen mecanismos comunes que se han conservado durante la evolución. ¿Cómo se forman y mantienen los NDRs? Estudios a nivel de genoma completo han determinado que los complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP juegan un papel clave en este fenómeno, donde existen complejos denominados “despejadores”, que abren y forman los NDRs, y complejos denominados “cubridores”, que cierran los NDRs. Además, otros estudios han encontrado una relación entre la acción de los complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP y la presencia de los tractos poli (dA:dT), donde la acción de factores de transcripción también estaría implicada. Sin embargo, aún se desconocen los mecanismos moleculares de la comunicación que existe entre los diferentes elementos que se encuentran en los NDRs. Por este motivo, en el presente trabajo buscamos determinar la influencia de los tractos poli (dA:dT) sobre la actividad remodeladora de nucleosomas de los complejos ISW1a, RSC y ySWI/SNF, los cuales cumplen diferentes roles en la mantención de los NDRs. Además, estudiamos cómo factores de transcripción pueden influir en la dinámica entre estas secuencias y los complejos estudiados. Para llevar a cabo nuestro estudio, usamos sondasmononucleoso-males reconstituidas in vitro que poseían diferentes configuraciones de los tractos poli (dA:dT), con las que se ejecutaron ensayos de remodelación analizando la acción de los complejos purificados. En nuestros resultados hallamos que estas secuencias pueden afectar de manera directa varios aspectos de la acción de estos complejos, como: la unión al nucleosoma, la intensidad de la actividad de remodelación y la dirección en que ejecutan ésta. Además, observamos que la orientación de los tractos poli (dA:dT) afecta diferencialmente a los complejos remodeladores de cromatina estudiados. Por otro lado, encontramos que los factores de transcripción podrían ejercer efectos diferenciales sobre ISW1a y RSC. Estos resultados realzan la importancia y el impacto que tienen los tractos poli (dA:dT) en el posicionamiento nucleosomal y ayudan a dilucidar los mecanismos mediante los cuales estas secuencias ejercen sus efectos.Item Interacción diferencial de las isoformas de hC/EBPβ con proteínas HMG(Universidad de Concepción., 2017) Amigo Bastías, Roberto Antonio; Gutiérrez Contreras, José LeonardoLa transcripción es un proceso altamente regulado, en el cual existe la participación de una gran cantidad de proteínas como los factores de transcripción, complejos remodeladores de cromatina y otras proteínas nucleares. Entre estas últimas se encuentran las proteínas HMG, las cuales tienen una función directa en la regulación del estado de la cromatina al tener la capacidad de doblar el ADN, competir con la histona H1 por sitios de unión a la cromatina y, en algunos casos, de estimular actividad remodeladora de cromatina dependiente de ATP. Así, estas proteínas pueden facilitar la acción de complejos remodeladores de cromatina y factores de transcripción, lo que se traduce usualmente en una activación de la transcripción. Entre los factores de transcripción con los cuales se ha descrito participación junto a proteínas HMG se encuentra C/EBPβ, un factor que participa en procesos de diferenciación y proliferación, entre otros. Esta proteína se presenta como tres isoformas: C/EBPβ1, C/EBPβ2 y C/EBPβ3, en donde generalmente C/EBPβ1 y C/EBPβ2 actúan como activadores transcripcionales, mientras que C/EBPβ3 actúa como un represor transcripcional. Se ha descrito que hC/EBPβ y HMGA1 interaccionan físicamente y esta última estimula la unión de C/EBPβ al promotor del gen del receptor de insulina (INSR) humano. Sin embargo, no se ha determinado si existe interacción diferencial entre las isoformas de C/EBPβ con HMGA1. Para HMGB1 solo se ha descrito una posible interacción física con C/EBPβ1 en forma teórica. En este contexto, análisis de GST pull-down asociados a espectrometría de masas realizados en nuestro laboratorio sugirieron la existencia de interacción diferencial entre las isoformas de hC/EBPβ y HMGA1 (igualmente para HMGB1). Por otro lado, también se observó interacción entre hC/EBPβ3 y la histona H1. En esta tesis se buscó verificar la existencia de estas interacciones, a través de ensayos de GST pull-down asociados a inmunodetección, analizando la influencia de C/EBPβ sobre la unión de HMGB1 y HMGA1 a regiones regulatorias de genes, mediante ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Para los ensayos de ChIP, se seleccionó genes blanco analizando por qRT-PCR variaciones en niveles de ARNm tras sobreexpresión de cada isoforma de C/EBPβ. Se realizaron además ensayos de EMSA para observar la influencia de estas interacciones sobre la unión de las isoformas de C/EBPβ y las proteínas HMG a sus secuencias en el ADN. Los resultados obtenidos, muestran la existencia de interacción diferencial entre las isoformas de C/EBPβ y las proteínas HMG, lo cual no se observó para la histona H1. Por otro lado, nuestros ensayos de qRT-PCR mostraron que los genes ALB, SMAD6, BRCA2, INSR y CCND1 son regulados de manera diferencial por las isoformas de C/EBPβ. Adicionalmente, los análisis de ChIP mostraron que al sobreexpresar C/EBPβ1 aumenta la unión de HMGB1 a los promotores de estos genes blanco, con similar resultado para HMGA1 en algunos de estos genes. Sin embargo, en los ensayos de EMSA no se observó el mismo efecto para HMGA1, situación que podría deberse a la distancia en los probadores utilizados entre el sitio de unión para HMGA1 y C/EBPβ, como lo sugieren análisis adicionales de este tipo realizados en nuestro estudio. Los resultados obtenidos en esta tesis conforman una base que estimula la realización de estudios futuros que aborden aspectos funcionales de la interacción diferencial de las isoformas de C/EBPβ con estas proteínas HMG, como es estudiar condiciones fisiológicas bajo las cuales estén ocurriendo estas interacciones, influencia de la distancia entre los sitios de unión para C/EBPβ y HMGA1 y el efecto de estas interacciones sobre la acción de otras proteínas o complejos de proteínas que puedan afectar la regulación transcripcional.