Tesis Doctorado

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Browsing Tesis Doctorado by Author "Bello Toledo, Helia Magaly"

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    Fenotipo heterorresistente a colistín y su relación con la expresión capsular en cepas de Klebsiella pneumoniae productoras de β-lactamasas de espectro extendido.
    (Universidad de Concepción., 2021) Morales León, Felipe Eduardo; Bello Toledo, Helia Magaly
    En los últimos años, se ha observado un aumento en la prevalencia de infecciones provocadas por enterobacterias, como Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Serratia spp., Proteus spp. portadoras de determinantes múltiples de resistencia antibiótica, los cuales son consideradas una amenaza mundial dada la escasa disponibilidad de nuevos antibióticos efectivos. Al respecto, las especies que comprenden el complejo Klebsiella pneumoniae, incluyendo K. pneumoniae sensu stricto y K. variicola subsp. variicola, han emergido como importantes patógenos oportunistas multirresistentes, relacionadas con Infecciones Asociadas con la Atención en Salud (IAAS). A lo anterior, destaca la alta prevalencia de especies portadoras de genes codificantes de β-lactamasas de espectro extendido (BLEE) tipo blaCTX-M, blaSHV, blaTEM-2, y carbapenemasas principalmente blaKPC, para las cuales existen pocas opciones de tratamiento. En este contexto, colistín resulta como una última opción de tratamiento efectiva. Pese a lo anterior, resulta preocupante el hecho de la existencia de cepas portadoras de un fenotipo heterorresistentes (HR) a colistín (CST), lo cual podría llevar a la selección de cepas más resistentes con un posible incremento en la tasa de mortalidad. Actualmente, los mecanismos involucrados con el fenotipo heterorresistente a colistín (CST-HR) no están completamente dilucidados. Sin embargo, la evidencia existente estima que son las mutaciones del gen regulador mgrB o mutaciones en alguno de los genes del sistema de dos-componentes como phoPQ, pmrAB, pmrC o crrAB los cuales están relacionados con la expresión de HR. Por su parte, es de sumo interés interesante indagar que otros mecanismos de resistencia no cromosómicos, tales como la hiperproducción capsular, pueden contribuir a la existencia del fenotipo HR. Así, el objetivo de esta tesis fue caracterizar los mecanismos involucrados en el fenotipo CST-HR en cepas de K. pneumoniae productoras de BLEE. Para esto, se identificó la presencia de cepas HR por medio de un análisis de perfil poblacional (PAP) sobre 60 cepas de K. pneumoniae productoras de BLEE, todas susceptibles a colistín. Las cepas HR fueron aisladas y se realizaron pasos sucesivos durante 5 generaciones. Posteriormente, se determinaron los parámetros de crecimiento bacteriano y se realizó la secuenciación del genoma completo (Illumina® MiSeq) utilizando Spades V.3.9. para su posterior ensamblaje. Con los datos obtenidos, se realizó el estudio de los mecanismos de resistencia a colistín empleando el software Galaxy web Server utilizando una base de datos local empleando K. pneumoniae MGH78578 como genoma de referencia para una cepa susceptible a colistín. El estudio anterior fue complementado con la determinación de mutaciones en reguladores wzi, wzc, rcsABC y lon, los cuales se relacionan con la expresión capsular. Adicionalmente, se determinó el nivel de expresión relativa de los genes phoPQ, pmrABD y mgrB y se comparó la cantidad de polisacárido capsular y el potencial Z (Zetasizer Nano ZS90 - Malvern Instrument® ) entre las cepas susceptibles y resistentes, empleando el método fenol-agua ácido sulfúrico y la movilidad electroforética, respectivamente. Finalmente, en el mismo grupo de 60 cepas de K. pneumoniae portadoras de BLEE, se estudió la existencia del fenotipo hipermucoviscoso e hipervirulento realizando un screening con el test de filancia y la búsqueda de genes de virulencia magA, rmpA/A2, ybtS, entre otros, mediante PCR múltiple. En las 60 cepas de K. pneumoniae se encontró ocho cepas con un fenotipo CST-HR, con MIC50 de colistin igual a 50 µg/mL. Además, estas cepas poseen múltiples genes de resistencia destacando la presencia de blaCTX-M-15 y blaCTX-M-2 ; blaSHV-12 y blaOXA-10. Se determinó que las cepas pertenecen a tres linajes diferentes (ST11; ST25 y ST1161) siendo el K.-locus 2 el más prevalente. Por otra parte, se destaca la primera descripción de CST-HR en cepas de ST1161, ST de descripción endémica en Chile. Sobre los mecanismos de resistencia a colistin, se identificó la presencia de múltiples mutaciones en los genes cromosómicos pmrB, phoPQ y mgrB, algunos de los cuales no han sido descritos previamente. Por su parte, se determinaron cambios en los niveles de expresión de los genes reguladores, destacando la disminución en la expresión relativa en mgrB y pmrBD, las cuales concuerdan con la expresión de resistencia a colistín. Por otro lado, se determinó que las cepas CST-HR poseen una carga superficial menos electronegativa y probablemente, esta no se encuentra relacionada con la cantidad de polisacárido capsular. Por su parte, se determinó la relación causal entre la existencia de mutaciones en crrB y la mayor cantidad de polisacárido observada en las cepas HR. Además, se identificó la presencia de dos cepas, una de K. pneumoniae y otra de K. variicola, portadoras de un fenotipo y genotipo hipermucoviscoso e hipervirulento, siendo esta la primera descripción formal en Chile. Finalmente, como conclusión, fue posible identificar la existencia de cepas de K. pneumoniae productoras de BLEE, portadoras de un fenotipo estable de heterorresistencia a colistín, la cuales evidencian niveles elevados de resistencia al antibiótico. De las cepas identificadas, se logró establecer los mecanismos genéticos responsables de la expresión fenotípica de resistencia a colistín las cuales se relacionan con la existencia de alteraciones en el nivel de expresión de genes claves en la incorporación de resistencia a colistín, probablemente, como una consecuencia de las mutaciones identificadas. Se determinó que las cepas heterorresistentes producen una mayor cantidad de polisacárido capsular en comparación a las cepas susceptibles, y que el serotipo capsular presente en las cepas de Klebsiella pneumoniae estudiadas no guardan relación con la existencia del fenotipo HR.
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    Microbiota bacteriana asociada a conducto radicular con diagnóstico de periodontitis apical crónica persistente y rol de nanopartículas de cobre como nuevo antimicrobiano endodóntico
    (Universidad de Concepción., 2018) Sánchez Sanhueza, Gabriela; Bello Toledo, Helia Magaly
    A nivel mundial se describe una alta prevalencia de periodontitis apical crónica persistente en dientes obturados con lesión apical, asociada a persistencia bacteriana, que va desde 40 % a 61 %. En Chile, la frecuencia de fracasos de tratamientos endodónticos, se informa en 55 %;sin embargo, estos resultados se basan sólo en parámetros clínicos, sin ninguna evidencia microbiológica. Los protocolos de medicación utilizados en endodoncia en Chile se basan en formulaciones diseñadas y utilizadas en el extranjero, para otras poblaciones del mundo. Las bacterias aisladas de conductos radiculares pueden establecerse en biopelículas intraconducto en los túbulos dentinarios, y la captación y penetración de los agentes antimicrobianos en ellos son elementos que hay que tener en consideración en los resultados terapéuticos. Las nanopartículas metálicas son potencialmente útiles dentro de este contexto, ya que por sus características físico-químicas podrían penetrar en la biopelícula, actuando como antimicrobianos a una concentración muy pequeña. El objetivo de esta tesis fue determinar la composición de la microbiota bacteriana asociada a conductos radiculares con diagnóstico deperiodontitis apical crónica persistente y evaluar el rol de nanopartículas de cobre (NPCu) como un nuevo agente antimicrobiano intraconducto. De un universo de 250 piezas dentarias diagnosticadas con periodontitis apical crónica persistente en el periodo de julio a noviembre de 2015, se obtuvo 24 muestras desde pacientes que cumplieron con los criterios de inclusión del estudio. Las características clínicas más relevantes fueron registradas. Se procedió a extraer el ADN bacteriano y a amplificar las regiones variables V3 y V4 del gen ARNr 16S. El producto de amplificación fue secuenciado mediante Illumina MiSeq System. Posteriormente se procesaron los datos utilizando la aplicación bioinformática Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME). Las lecturas no quiméricas representativas se agruparon en unidades taxonómicas operacionales (OTUs) utilizando un umbral de identidad de 97% y se clasificaron taxonómicamente mediante coincidencias con secuencias en la base de datos Greengenes (versión gg_13_5). El porcentaje de cobertura se estimó mediante el método estimador de cobertura no paramétrico de Good; Alfa diversidad se evaluó con un estimador de riqueza Chao1; y el índice de diversidad de Shannon se calculó a través de la herramienta bioinformática Mothur. Las estructuras de comunidades microbianas en diferentes muestras se compararon utilizando UniFrac basado en la relación filogenética de lecturas representativas de diferentes muestras, y las distancias UniFrac ponderadas se utilizaron para construir un análisis de coordenadas principales. Desde todas las muestras se aislaron e identificaron las especies prevalentes cultivables a través de sistemas bioquímicos como API® Rapid ID 32 A (BioMerieux, Marcy-l’Etoile, Francia) y API® 20E (BioMerieux, Marcy-l’Etoile, Francia). Finalmente, se corroboró la identificacion de cada especie bacteriana mediante secuenciación del producto de amplificación con reacción en cadena de la polimerasa convencional para el gen ARNr16S empleando los partidores P0/P6 o rrs. Posteriormente, alas cepas identificadas se les determinó el comportamiento frente antimicrobianos de uso común en endodoncia y a NPCu tanto en su forma planctónica como en tres modelos ex vivo de biopelícula formado sobre paredes dentinarias tanto con técnicasrecuento de unidades formadoras de colonia y microscopía confocal. Por último, se relacionó la diversidad bacteriana y el comportamiento de las cepas frente a los antimicrobianos con los parámetros clínicos de los pacientes. El análisis de coordenadas principales PCoA indicó una separación entre individuos con historia clínica ASA I y ASA II-III basada en la relación filogenética de la comunidad bacteriana presente en cada muestra. Las estimaciones con el índice Chao1 no fueron diferentes entre los grupos, excepto en lo que respecta a la historia clínica, donde ASA II-III presentó mayor estimación de riqueza, así como mayor índice de diversidad de Shannon. El nivel de PAI 5 aumentó el índice de diversidad de Shannon en comparación con PAI 4 y este índice se redujo en pacientes sintomáticos. En todos los grupos, Proteobacteria fue el phylum más abundante seguido de Bacteroidetes. Sin duda, la familia de mayor abundancia fue Pseudomonadaceae, seguida de pequeñas variaciones en la abundancia de otros grupos taxonómicos dependiendo de la historia del paciente. Se identificaron 16 cepas aisladas en condiciones aeróbicas, 10 de las cuales correspondieron a Pseudomonas spp. y otras 6 cepas correspondientes a los géneros Streptococcus y Staphylococcus. Por otro lado, se identificaron 15 cepas aisladas en condiciones anaeróbicas, 6 de las cuales correspondieron a anaerobios estrictos, principalmente Propionibacterium spp. y otras 10 cepas anaerobias facultativas correspondientes principalmente al género Streptococcus spp. y Staphylococcus spp. Se obtuvo para todas las cepas la media geométrica de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) siendo de amoxicilina 27,44 μg/mL, de amoxicilina/ácido clavulánico 10,63 μg/mL, de tetraciclina 2,25 μg/mL, de claritromicina 59,7 μg/mL, de eritromicina 65,6 μg/mLy de metronidazol 114,03 μg/mL. A las 31 cepas bacterianas identificadas se les determinó la CMI y la concentracion mínima bactericida (CMB) de nanoalambres de cobre (NWCu) y NPCu, utilizando como control de nanopartículas de Oxido de Zinc (NPZnO). Los valores de CMI y CMB estuvieron en el intervalo de 100 y >2500 μg/mL y 250 y >2.500 μg/mL, respectivamente. Sobre la base de valores medios, la actividad antibacteriana de las tres nanoestructuras en orden ascendente fue NPCu, NWCu y NPZnO. NPCu mostraron buena actividad antimicrobiana a las concentraciones ensayadas, en comparación con otros informes de literatura. Al probar un primer modelo ex vivo de biopelícula aeróbica no madura multiespecie, tratada con CuNP, con la técnica de recuento en placa, se presentan diferencias significativas entre la aplicación de CuNP como medicación y como irrigante, comportándose de igual manera con la medicación convencional de hidróxido de calcio, a 1 y 7 días. En los ensayos de evaluación de viabilidad celular con microscopía confocal sobre un segundo modelo de biopelícula aeróbica no madura multiespecie, tratada con NWCu a una concentración equivalente a 6xCMI (1500 μg/mL) para E. faecalis , se observó que a mayor tiempo de exposición a las NWCu existió una disminución de la viabilidad. Con un tercer modelo ex vivo de biopelícula, en este caso, anaeróbica madura y multiespecie, se determinó que NPCu, tienen mayor actividad antimicrobiana comparada con otros sistemas de irrigación endodóntica. Se concluye que la microbiota bacteriana asociada a conductos radiculares con diagnóstico de periodontitis apical crónica persistente en el ámbito local es diversa, y evidencia altos niveles de resistencia a los antibacterianos de uso común en el tratamiento endodóntico. Los resultados sugieren que la constitución bacteriana de la periodontitis apical crónica persistente está en relación con al menos dos características clínicas de los pacientes. Finalmente, las nanopartículas de cobre (NPCu) pueden ser una alternativa de tratamiento más efectiva que los antibacterianos intraconducto convencionales empleados actualmente en el tratamiento endodóntico.
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