Tesis Doctorado
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Browsing Tesis Doctorado by Author "Bunster Balocchi, Marta Cecilia"
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Item Caracterización estructural de una proteína de unión γ 33 asociada a la R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis (Rhodophyta: racilariaceae).(Universidad de Concepción., 2018) Vásquez Suárez, Aleikar José; Bunster Balocchi, Marta Cecilia; Martínez Oyanedel, JoséLos ficobilisomas (PBS) son complejos proteicos accesorios captadores de luz, constituídos principalmente por ficobiliproteinas (PBPs). La luz absorbida por las PBPs es eficientemente transferida a los centros de reacción fotosintética mediante bilinas o cromóforos que se encuentran covalentemente unidos a residuos específicos de cisteínas. Además de las ficobiliproteínas, el PBS contiene proteínas de unión responsables del ensamblaje y la estabilización de todo el complejo y el ajuste de los pasos de transferencia de energía entre los cromóforos. La proteína de unión cromoforilada (γ33) de Gracilaria chilensis, es un linker de varillas que se encuentra asociada a hexámeros (αβ)6 de R-ficoeritrina (R-PE). Debido a que su rol en el proceso de transferencia de energía aún no está claro, estudios con enfoques estructurales podrían ayudar a entender dicho proceso. Inicialmente, se realizó el clonamiento y secuenciación del gen codificante de la subunidad γ33. La secuencia proteica fue analizada luego de su traducción in silico, en la que se determinó que la proteína consta de 318 residuos aminoacídicos incluyendo un péptido de tránsito cloroplástico (cTP) de 39 aminoácidos en el extremo N-terminal. Se realizaron análisis espectroscópicos del linker purificado a partir de R-PE y mediante espectrometría de masas se confirmó su secuencia. Usando subunidades α y β R-PE como sondas espectroscópicas en ensayos de denaturación, se dedujo la existencia de una ficourobilina (PUB) unida a dos residuos Cis en la subunidad γ33, y luego el análisis de espectrometría de masas permitió confirmar los sitios de unión en las Cis62 y Cis73 (DL-PUB62/73). El análisis del espectro de absorción del ensayo de denaturación, en conjunto con la determinación de las áreas de los máximos de absorción, indican igual proporción PUB/PEB. Adicionalmente, datos obtenidos a partir de ensayos de entrecruzamiento químico acoplado a espectrometría de masa, difracción de rayos X junto con datos de crio-tomografía electrónica (Cryo-ET) del complejo R-PE se integraron para corregir y reconstruir un modelo de γ33 previamente obtenido a través de modelamiento por homología. La subunidad γ33 presenta dos repeticiones internas con nueve hélices α (H1-H9) entre ellas. El extremo N-terminal consta de un bucle largo con dos pequeñas α-hélices (N, N ’). Las repeticiones internas hacen contactos extensos con cierto estilo simétrico en la región interna del hexámero de R-PE. Las α-hélices H1, H2 y H3/H4 contactan con tres lados internos del mismo trímero (T1R-PE): en la α-hélice X de las subunidades α, y F y F’ de las subunidades β. El bucle que separa las α-hélices H1 y H2 interactúa principalmente con la hélice X de la subunidad α del trímero opuesto (T2R-PE). Las α-hélices H6, H7 y H8/H9 entran en contacto con tres lados internos del mismo trímero T2R-PE: en la α-hélice X de las subunidades α, y F y F’ de las subunidades β, como H1, H2 y H3/H4 en T1R-PE. El extremo N-terminal de la subunidad γ33 contiene un bucle largo que se repliega hacia la región de repetición que junto con una α-hélice corta (N’) sobresale ligeramente hacia el exterior de la cavidad y podría insertarse en el hexámero contiguo. El cromóforo unido a Cis-259 es una propuesta a partir de datos cristalográficos, y su entorno mantiene las características fisicoquímicas similares a los cromóforos asociados a α y β de otras PBPs, aunque con variaciones en los aminoácidos constituyentes que podrían explicar los sutiles cambios en las propiedades espectrales. Las cisteínas involucradas en la doble unión de la PUB se encuentran ubicadas en una región helicoidal en una conformación que recuerda la posición del DL-PUB50/61 en la subunidad β de R-PE.Item Resolución de la estructura terciaria de R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis.(Universidad de Concepción., 2000) Contreras Martel, Carlos; Bunster Balocchi, Marta CeciliaEl conocimiento de la estructura tridimensional de las proteínas ha sido una importante herramienta, tanto en el pasado como en el presente, para la comprensión de muchos fenómenos biológicos y juega un papel crucial en la biología molecular actual. La determinación de la estructura de proteínas por difracción de rayos-X constituye una poderosa técnica para su análisis estructural a nivel atómico, lo que permite correlacionar la estructura con la función. El presente trabajo se enfocó a la determinación de la estructura terciaria de R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis, proteína encargada de captar y transferir la energía luminosa en el ficobilisoma. El análisis de la estructura permite plantear un modelo de conducción de luz para esta proteína. R-ficoeritrina está constituida por dos tipos de cadenas: y , y por cadenas de unión que forman el agregado 6. La estructura tridimensional de este hexámero se logró mediante cristalografía y difracción de rayos-X. Se obtuvieron datos a 2,7 y 2,2 Å de resolución para sendos cristales. En ambos casos se obtuvieron los mismos parámetros de celda unidad (a=b=187 Å, c=59 Å; ==90º, =120º) y el grupo espacial R3. Los datos de la mayor resolución presentaron el fenómeno de macla. El problema de la fase se resolvió por reemplazo molecular empleando la estructura de R-PE de Polysiphonia urceolata. La solución de la estructura para el cristal maclado se realizó mediante el programa SHELX-97. Los factores R y Rfree obtenido al finalizar el refinamiento fueron 0,16 y 0,25 respectivamente. Cada uno de los residuos aminoacídicos de las cadenas y fueron correctamente asignados, siendo posteriormente confirmado por secuenciación química parcial de ambas Resolución de la estructura terciaria de R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis. Resumen XV cadenas. Se reconocieron claramente en los mapas de densidad electrónica dos cromóforos en la cadena (82 y 139), tres en la (82, 158 y 50/61) y una metilación sobre 72N. Además, se logró asignar una región helicoidal de seis residuos de la cadena de unión . En base al análisis estructural de los cromóforos se plantean posibles rutas de transferencia de energía en R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis, considerando la ubicación y las distancias intercromóforos. Las coordenadas de R-PE de Gracilaria chilensis fueron depositadas en el Protein Data Bank (1eyx.pdb), constituyendo la primera estructura tridimensional de una proteína resuelta en Chile.