Tesis Pregrado
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Browsing Tesis Pregrado by Subject "Alanina"
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Item Análisis de los residuos relevantes en la coordinación con el cofactor Manganeso en la Agmatinase Like protein (ALP).(Universidad de Concepción, 2024) Fuentes Leyton, Allison Marioth; Uribe Pérez, Elena AmparoLa agmatinase like protein (ALP) es una enzima que se clonó a partir de una librería de genes de cerebro de rata y presenta actividad agmatinasa, hidrolizando la agmatina a putrescina y urea. Esta enzima requiere Mn2+ como cofactor y posee un bajo porcentaje de identidad con las agmatinasas conocidas, no conservando los residuos de coordinación al metal activador. En trabajos previos del laboratorio por la falta de información estructural se realizó un modelo estructural de ALP, en el cual se propusieron 5 posibles residuos que interaccionarían con el cofactor Mn2+. Se generó una mutante triple (N213A/Q215A/D217A) y una mutante doble (E288A/K290A) de estos residuos y ambas mutantes no presentaron actividad enzimática. Esta tesis tiene como objetivo evaluar la participación de cada uno de los residuos de la mutante triple en la actividad y coordinación metálica de ALP. Para ello, se generaron mutantes simples reemplazando cada residuo por alanina a través de mutagénesis sitio dirigida, se purificó parcialmente cada enzima por cromatografía de intercambio aniónico y se analizaron sus parámetros cinéticos. Como resultado, se obtuvo que las tres mutantes simples presentaron valores de Km y Vmáx menores que la enzima silvestre. Para analizar la interacción enzima-Mn2+, se realizaron experimentos de activación enzimática, diálisis, hiperactivación, determinación del contenido metálico y especificidad de la activación con el metal y en todos los resultados las tres mutantes simples no mostraron diferencias con la enzima silvestre. Concluimos que las tres mutaciones simples afectaron el sitio activo de la enzima ya que alteraron sus parámetros cinéticos y postulamos que estos residuos se encuentran próximos al sitio activo. Dado que las mutaciones no alteraron la interacción enzima-Mn2+ concluimos que estos residuos no participan directamente como ligandos coordinantes del metal activador Mn2+.