Tesis Doctorado
Permanent URI for this collection
Browse
Browsing Tesis Doctorado by Subject "Biogénesis"
Now showing 1 - 1 of 1
Results Per Page
Sort Options
Item Definición del origen y potencial uso diagnóstico del ADN identificado en el medio de cultivo de embriones bovinos producidos in vitro(Universidad de Concepción, 2025) Caamaño Escobar, Diego Andrés; Rodríguez Álvarez, LleretnyEl término vesícula extracelular (EVs) se refiere a cualquier tipo de nanopartícula rodeada por una bicapa lipídica. Estas vesículas son incapaces de replicarse debido a la ausencia de núcleo y son liberadas por todas las células. Las EVs son clasificadas según distintos criterios, como el tamaño, el órgano de origen o su biogénesis. Dependiendo de su proceso de formación, las células liberan tres tipos principales de EVs: exosomas, que derivan de cuerpos multivesiculares; microvesículas, que se generan por evaginación de la membrana plasmática; y cuerpos apoptóticos, que se producen durante la apoptosis. Las EVs desempeñan un papel crucial en la comunicación intercelular, determinado por su contenido molecular. Estas vesículas pueden transportar proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Este mensaje es protegido al interior de las EVs y es transferido a otra célula, modificando su función, participando en diversos procesos fisiopatológicos, incluidos trastornos neurodegenerativos, inmunológicos, vasculares, así como en el cáncer. Además, las EVs contribuyen a procesos biológicos normales, como la proliferación celular, la diferenciación celular y el desarrollo embrionario. Además, las EVs han estado implicadas en la diferenciación de ovocitos y espermatozoides, la maduración ovocitaria, la fertilización y la implantación embrionaria. Los embriones preimplantatorios, al igual que otras células, pueden liberar EVs. Estas EVs embrionarias contienen cargo y participan en el diálogo materno-embrionario. Las características de las EVs, como su tamaño, concentración o contenido, varían en función de la competencia, calidad o estadio de desarrollo del embrión. Se ha identificado gDNA embrionario en medios de cultivo como herramienta para el diagnóstico genético, aunque su concordancia con el ADN embrionario ha mostrado una concordancia solo del 30-90%. Esta discordancia puede explicarse por la presencia de contaminantes de ADN derivados de células del cúmulo, espermatozoides y/o proteínas del medio de cultivo. Se ha reportado la presencia de gDNA y mtDNA en el interior de EVs liberadas por embriones humanos, murinos y porcinos, lo que sugiere un posible uso de estas vesículas como herramienta para la genotipificación embrionaria. Por esta razón, el objetivo general de este estudio fue determinar la presencia de gDNA dentro de EVs liberadas por embriones bovinos Pre-implantatorios y su potencial uso para el diagnóstico genético. Para ello, se produjeron embriones bovinos mediante fertilización in vitro o partenogénesis (según el experimento específico) y cultivados en grupos hasta el día 5 (estadio de mórula). Posteriormente, las mórulas fueron cultivadas individualmente hasta el día 7 (estadio de blastocisto), momento en el cual fueron recolectadas junto con su medio de cultivo correspondiente. El medio condicionado fue utilizado para la obtención de EVs mediante tres protocolos diferentes de aislamiento con el fin de evaluar la eficiencia de cada método. Las EVs aisladas fueron caracterizadas mediante análisis de seguimiento de nanopartículas, microscopía electrónica de transmisión y Western blot para la detección de proteínas específicas. La presencia de ADN fue determinada mediante múltiples técnicas, y la genotipificación embrionaria se llevó a cabo mediante PCR en tiempo real. Además, algunas muestras fueron secuenciadas y analizadas para evaluar la representación génica. Finalmente, se determinó la tasa de apoptosis y la concentración total de ADN mediante espectrofotometría y análisis por NTA para evaluar la correlación entre ambas variables. No se encontraron diferencias significativas entre los tres protocolos de aislamiento en cuanto a las características poblacionales de las EVs, aunque sí en el tiempo requerido. Se logró detectar la presencia de ADN en el interior de las EVs mediante distintas técnicas, confirmando su existencia. El análisis de secuenciación reveló la presencia de 5,664 genes, incluyendo algunos involucrados en el desarrollo embrionario. El análisis por PCR confirmó la presencia e identificación de múltiples genes, incluyendo genes ligados al sexo (SRY y USP9Y). Todos los embriones presentaron al menos una célula en apoptosis. Las mórulas bloqueadas mostraron una mayor tasa de apoptosis, y los embriones derivados de partenogénesis presentaron una mayor concentración de ADN. No se encontró correlación entre la tasa de apoptosis y la concentración de ADN en las EVs. Los resultados confirman que los embriones bovinos preimplantacionales liberan EVs que contienen ADN en su interior, independientemente de su calidad. Además, se demostró que este ADN puede utilizarse para la genotipificación embrionaria mediante PCR en tiempo real, aunque con ciertas limitaciones en función de la cantidad de ADN disponible. Finalmente, se determinó que la concentración de ADN en las EVs es independiente de la tasa de apoptosis embrionaria y la cantidad detectada y genes identificado puede variar según la competencia o calidad del embrión.