Tesis Doctorado
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Item Análisis de la estructura cuaternaria del transportador de ácido ascórbico SVCT2(Universidad de Concepción., 2016) Gatica Miranda, Marcell Alejandra; Rivas Rocco, CoraliaLa forma reducida de la vitamina C, el ácido ascórbico (AA), es transportado al interior de las células por la familia de cotransportadores de sodio-ascorbato SVCT, con 2 formas funcionalmente activas, SVCT1 y SVCT2. Se ha propuesto un modelo funcional para el ciclo de transporte de ambos SVCTs, en el cual el transportador presenta un sitio de unión para el sustrato AA, al menos dos sitios de unión para Na+ y un sitio de unión Ca2+ y Mg2+. Durante el ciclo de transporte ambos sitios de unión a sodio interactúan entre ellos y además interaccionan con el sitio de unión a AA, el cual a su vez afectaría recíprocamente la interacción entre ambos sitios de unión a sodio. De igual manera el sitio de unión a cationes divalentes interacciona con el sitio de unión a AA ya que se ha visto que en ausencia de cationes divalentes el transportador es inactivo. Aunque existen numerosos estudios acerca de los aspectos cinéticos y funcionales de SVCT2, no existe información estructural disponible para este transportador. Análisis de hidrofobicidad revelaron que los SVCTs son altamente hidrofóbicos y están compuestas por 12 hélices de transmembrana unidas entre sí por lazos ricos en aminoácidos hidrofílicos y con los extremos amino y carboxilo-terminal orientados hacia la cara citoplasmática de la célula. Sin embargo hasta la fecha, no se tienen antecedentes acerca de la estructura 3D de SVCT2 ni del estado de oligomerización de este transportador en la membrana celular. Por otro lado, existe evidencia que indica que la oligomerización es una característica esencial para la estructura y función de los transportadores de membrana. Cristalización de diferentes transportadores de membrana bacterianos junto a diversos estudios utilizando técnicas alternativas a la cristalización, como ensayos de entrecruzamiento, transferencia de energía de resonancia de Föster (FRET), coinmunoprecipitación, entre otras, han llevado a proponer que aproximadamente el 70% de los transportadores están formando oligómeros en la membrana plasmática, por ejemplo, transportadores que usan el gradiente electroquímico como energía para catalizar la translocación de su sustrato, existen como oligómeros de alto orden, dímeros (vSGLT y LeuTA), trímeros (AcrB, GltpH y BetP) o tetrámeros (GLUT1)), aunque evidencia de monómeros (Mhp1) también fue reportada. Recientes estudios de microscopía electrónica en hSVCT1 expresado en ovocito, reveló la presencia de dos poblaciones de partículas con distinta forma y estructura a baja resolución lo que sugiere la presencia de monómeros y dímeros del transportador. Por otro lado, ensayos de entrecruzamiento químico confirmaron la presencia de dímeros en membranas aisladas de estos ovocitos, aunque a concentraciones menores comparadas con el monómero de hSVCT1. La información estructural es importante para comprender el mecanismo de estos transportadores a nivel molecular. Por lo que el propósito de esta tesis fue determinar la estructura cuaternaria de hSVCT2. Ensayos de entrecruzamiento químico de hSVCT2 seguido de inmunomarcaje con anticuerpos específicos sugieren que hSVCT2 existe como dímero. Además, realizamos ensayos de transporte de AA para comprender la significancia funcional de la oligomerización de hSVCT2 y así poder determinar la unidad mínima funcional de este transportador de membrana. Dentro de estos ensayos realizamos estudios funcionales de co-expresión del transportador activo (nativo) y una mutante inactiva de hSVCT2 (H109Q), que revelaron que hSVCT2 nativo no restauró la capacidad de transporte de la mutante inactiva, ni esta última suprimió la capacidad de transporte del transportador nativo. Por otro lado, al coexpresar el transportador nativo junto a una mutante (C113S o C160S) que presenta características cinéticas alteradas (Km aparente de transporte, al menos 5 veces superior a la del transportador nativo), revelaron que a todas las razones moleculares ensayadas se detectó un único componente cinético que corresponde a la proteína que se expresa en mayor proporción. A partir de estos resultados, podemos proponer que hSVCT2 forma dímeros en membrana celular, que la unidad mínima de transporte dentro del dímero de hSVCT2 podría ser el monómero y que los monómeros dentro del dímero son capaces de interactuar entre ellos modulando sus propiedades cinéticas.Item La forma oxidada de vitamina C, ácido deshidroascórbico, regula la necroptosis neuronal durante un periodo de isquemia y reperfusión cerebral.(Universidad de Concepción., 2019) Ferrada Cofré, Luciano Esteban; Nualart Santander, FranciscoLa vitamina C es encontrada en dos estados, el estado reducido ácido ascórbico (AA), y su estado oxidado ácido deshidroascórbico (DHA). Bajo condiciones fisiológicas, el AA es el principal antioxidante del sistema nervioso central. Sin embargo, bajo condiciones fisiopatológicas como el infarto cerebral, el AA es oxidado hasta DHA. De manera interesante, el infarto cerebral induce un tipo de muerte particular llamado necroptosis, y hasta la fecha se desconocen los mecanismos iniciadores de la necroptosis en contextos fisiopatológicos. Al mismo tiempo, en diversos modelos celulares se ha propuesto que la acumulación de DHA se encuentra asociado a procesos de muerte con características necróticas. De esta forma, en esta tesis propusimos evaluar si la acumulación intracelular de DHA en la neurona podría inducir muerte por necroptosis. Con el objetivo de poner a prueba nuestra hipótesis, generamos nuestro propio modelo de infarto in vitro, debido a que los modelos convencionales inducen muerte por apoptosis. Nuestro modelo de estudio fue validado inhibiendo la apoptosis, la necroptosis, la fisión mitocondrial y la generación de especies reactivas de oxígeno. Para analizar las características de desintegración celular, utilizamos microscopía confocal espectral de célula viva 4D con 5 canales donde se analizó de manera simultánea la morfología celular, actividad mitocondrial, integridad del núcleo y la integridad de la membrana plasmática. Estos experimentos, fueron un elemento clave para poder determinar el proceso de muerte inducido por la acumulación intracelular de DHA. Los estudios de microscopía de célula viva fueron complementados con análisis morfológicos, utilizando reconstrucciones 3D y cuantificaciones 3D especializadas con el software Imaris, de las células en proceso de muerte. Reforzando estos experimentos, mediante microscopía de super resolución SIM, analizamos en detalle el tamaño y la morfología mitocondrial en condiciones de estrés oxidativo y de acumulación intracelular de DHA. De manera interesante, las reconstrucciones 3D mostraron patrones de distribución no descritos hasta la fecha en respuesta al tratamiento con AA o a la acumulación de DHA, que involucran a los transportadores de vitamina C y a proteínas claves de la necroptosis. Por otra parte, para determinar la participación del AA en el proceso de muerte sobre expresamos, de manera estable mediante infección lentiviral, el transportador de AA SVCT2; y por otro lado, generamos clones KO para SVCT2 a partir de cell sorting de célula única y la tecnología de CRISPR/Cas9, estableciendo la primera línea celular neuronal delecionada para SVCT2 descrita hasta la fecha. Sorprendentemente, encontramos que la acumulación intracelular de DHA en la neurona induce drásticos cambios morfológicos que corresponden a características de desintegración necroptótica. Mas aún, mediante la tecnología de CRISPR/Cas9 delecionamos la proteína ejecutora de la necroptosis, validando de esta forma que DHA puede inducir muerte específicamente por necroptosis. Usando la microscopía de resolución súper SIM para analizar el tamaño y la morfología mitocondrial en condiciones de estrés oxidativo y acumulación de DHA intracelular, encontramos que la oxidación de DHA favorece la fragmentación mitocondrial. Sin embargo, nuestros resultados sugieren que el daño mitocondrial no estaría involucrado en el proceso de muerte. Por lo tanto, nuestro trabajo propone a DHA como una molécula multifacética que podría tener implicaciones en los procesos de muerte no apoptóticos, regulando la necroptosis neuronal en períodos de estrés oxidativo agudo, como el generado durante el accidente cerebrovascular. Finalmente, proponemos que el DHA es un desafío para la comunidad científica para desarrollar nuevos conceptos con importantes implicaciones terapéuticas.