Tesis Doctorado
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Browsing Tesis Doctorado by Subject "ADN - Procesamiento de Datos"
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Item Caracterización de la función de las proteínas HMGB sobre la actividad de los complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP.(Universidad de Concepción., 2013) Hepp Castro, Matías Ignacio; Gutiérrez Contreras, José LeonardoLa compactación del ADN en la cromatina es fundamental en la organización y utilización del genoma. Los nucleosomas son la unidad básica de la cromatina, su formación y desensamble es un proceso dinámico, el que ocurre esencialmente por acción de los complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP. Uno de estos es SWI/SNF (SWItching defective/Sucrose Non Fermenting), que posee la capacidad de desplazar en cis el octámero de histonas (sliding) y de transferir octámeros entre distintos segmentos de ADN. Asociado a esta última actividad se describe un fenómeno denominado eviction, consistente en el desensamble de un nucleosoma. Se ha descrito la existencia de factores que incrementan la actividad remodeladora de los complejos dependientes de ATP. En este sentido, estudios realizados con una proteína nuclear no histona, denominada HMGB1 (High Mobility Group B1), apuntan a que esta proteína interacciona con el ADN próximo a los nucleosomas y facilita la actividad de ciertos complejos remodeladores de cromatina. Sin embargo, se desconocen los efectos de proteínas de este tipo sobre las distintas actividades catalíticas de estos complejos. Con el objeto de profundizar el conocimiento sobre los factores responsables de modular la actividad de complejos remodeladores dependientes de ATP, la presente tesis abordó el estudio del efecto de proteínas del tipo HMGB sobre la actividad de SWI/SNF. Con este propósito se generaron proteínas HMGB silvestres recombinantes de humano y levadura, más mutantes de estas últimas. Las proteínas con las que se trabajó fueron Nhp6A, Nhp6B, Hmo1 (levadura) y HMGB1 (humana). Como sustrato de la actividad remodeladora se reconstituyó mononucleosomas sobre segmentos de ADN marcados radioactivamente. Se estudió la influencia de las proteínas HMGB sobre la actividad remodeladora de SWI/SNF de levadura y sobre la acción conjunta del factor de transcripción Gal4-VP16 y SWI/SNF. Además se evaluó los efectos de estas proteínas sobre la unión de SWI/SNF al ADN y sobre el grado de hidrólisis de ATP que realiza este complejo durante su acción. Finalmente se realizaron estudios de ChIP-chip con el fin de analizar el reclutamiento de SWI/SNF a promotores específicos en función de la presencia o ausencia de las proteínas HMGB estudiadas. También se analizó el enriquecimiento de estas proteínas en el genoma completo de levadura. Posterior a esto, se analizó si en función de la presencia o ausencia de estas proteínas HMGB se altera el posicionamiento de nucleosomas en regiones promotoras de determinados genes. Nuestros estudios in vitro demuestran que las proteínas HMGB de levadura estimulan la actividad de complejos remodeladores de cromatina dependientes de ATP. Además nos permitieron entender parcialmente el mecanismo por el cual estarían actuando las HMGB sobre estos complejos. Los análisis in vivo permitieron observar que las proteínas HMGB afectan la permanencia del complejo SWI/SNF en regiones reguladoras de diversos genes, con un impacto en la estructura cromatínica de estas regiones.