Tesis Doctorado

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Clonamiento y caracterización molecular de la agmatinasa de cerebro de rata.
(Universidad de Concepción., 2005) Uribe Pérez, Elena Amparo; Carvajal Baeza, Nelson
Hasta hace muy poco tiempo se pensaba que la agmatina, compuesto resultante de la descarboxilación de la arginina, sólo se encontraba en microorganismos y plantas. Sin embargo recientemente se ha demostrado su presencia en algunos tejidos de mamíferos, especialmente en cerebro y también se han descrito algunas de sus posibles funciones. Entre estas funciones se destacan la estimulación de la liberación de catecolaminas e insulina y el aumento de la presión arterial. A nivel cerebral, se la ha descrito como ligando de receptores de imidazolina tipo I y II, de receptores -2 adrenérgicos y como estimulante de la liberación de hormonas hipotalámicas, por lo que se la ha definido como un neurotransmisor. Sin embargo, aún no se conocen las bases moleculares de los efectos observados, aunque resulta muy sugerente el efecto inhibidor de la agmatina sobre todas las formas de óxido nítrico sintasa (NOS), lo que ha llevado a postular que este compuesto podría actuar como regulador endógeno de los niveles de óxido nítrico. Muchas de las interrogantes acerca de la real participación de la agmatina en la función cerebral normal aún no tienen una respuesta clara, debido en parte al escaso conocimiento que se tiene acerca de los aspectos metabólicos de este compuesto en los mamíferos. Aunque se ha demostrado la conversión de agmatina en putrescina en el cerebro, la incertidumbre es tal que, ha sido explicada tanto por acción de una agmatinasa, como por una arginasa presente en este tejido. A pesar que, recientemente se ha comunicado el clonamiento de una agmatinasa humana, la actividad de la proteína recombinante es extraordinariamente baja y se encuentra en los límites de detección de los métodos empleados para medirlas. Considerando las acciones biológicas que se le han asignado a la agmatina y especialmente su posible acción como neurotransmisor y como una manera de contribuir al conocimiento del metabolismo de la agmatina, en este trabajo hemos propuesto que una agmatinasa participa en la regulación de los niveles de agmatina y por lo tanto de las acciones moduladoras de este metabolito en el cerebro de la rata. Específicamente, el presente trabajo de tesis doctoral tuvo los siguientes objetivos: 1) Demostrar la existencia de la agmatinasa en el cerebro de la rata y encontrar una explicación para los bajos niveles de actividad reportados en la literatura. 2) Aislar y secuenciar el gen de la agmatinasa de cerebro de rata, mediante análisis de una genoteca de cDNA. 3) Expresar el gen de la agmatinasa en células de E. coli y purificar la enzima recombinante. 4) Caracterizar la enzima recombinante. Los resultados obtenidos en este trabajo contribuyen en forma significativa al conocimiento del metabolismo de la agmatina en cerebro, en varios aspectos fundamentales. (a) Se detectó actividad agmatinasa en el cerebro de la rata y a pesar que esta fue muy baja, se pudo corroborar la presencia de la proteína mediante inmunodetección en cuerpos neuronales y en células gliales, especialmente en la zona del hipotálamo. (b) Se detectó, se purificó parcialmente y se caracterizó una actividad inhibidora de agmatinasa presente en el cerebro de la rata. Esta actividad se une reversiblemente a la enzima, depende del ion metálico Mn2+ y no es excluyente con el producto de la reacción, putrescina. No descartamos que corresponda a la misma agmatinasa y sugerimos que podría explicar en parte la baja actividad agmatinasa detectada en cerebro. (c) El análisis de una genoteca de cDNA de cerebro de rata, permitió identificar dos clones con una alta actividad agmatinasa (10 moles urea/h/mg de proteína). La proteína codificada por este cDNA se expresó y purificó a homogeneidad, la cual posee un peso aproximado de 58 KDa, que corresponde al tamaño deducido desde la secuencia nucleotídica. La proteína fue detectada por un anticuerpo monoclonal que reconoce un epítope de 6 histidinas, las que fueron adicionadas al extremo amino de la proteína para facilitar su purificación. La enzima purificada tiene un pH óptimo de 9,0, una Km de 2  0,2 mM para agmatina y requiere de iones metálicos, especialmente Mn2+ para su actividad catalítica, siendo sus características muy similares a las descritas para la enzima de E. coli. A pesar de esta similitud funcional la identidad de secuencia aminoacídica con la agmatinasa de E. coli y la humana es sólo de un 10 %. Contrariamente a lo esperado, la agmatinasa de rata no contiene los residuos conservados que son característicos de la familia de las arginasas y que participan en la unión del metal, en la unión del sustrato y en la catálisis misma. Esto es muy contradictorio, pues los genes de agmatinasa de mamíferos descritos hasta el momento codifican para proteínas que poseen estos residuos, pero son prácticamente inactivas desde el punto de vista enzimático.
Estudio de los determinantes estructurales de las diferencias de especificidad entre la arginasa de hígado humano y la agmatinasa de Escherichia coli.
(Universidad de Concepción., 2009) Orellana Orellana, María Soledad; Carvajal Baeza, Nelson
Las analogías entre la arginasa y la agmatinasa incluyen la estructura de sus sustratos (la agmatina es el derivado descarboxilado de la arginina), las reacciones que catalizan (hidrólisis con producción de urea), el requerimiento de Mn2+, las funciones equivalentes de residuos específicos y el mecanismo cinético de la reacción. Esto contrasta con sus marcadas diferencias de especificidad, ya que el sustrato de una prácticamente no es hidrolizado por la otra. Al comparar las estructuras cristalinas disponibles para las arginasas de hígado humano, de hígado de rata y de B. caldovelox, un modelo estructural que hemos generado para la agmatinasa de E. coli y la estructura cristalina de la agmatinasa de D. radiodurans, se observa una importante diferencia en la extensión de un lazo que contribuye a la formación del sitio activo y que contiene los residuos que interaccionan con el grupo alfa carboxilo de la arginina. Considerando estos hechos, en este trabajo hemos propuesto que los determinantes estructurales de la especificidad de la arginasa y la agmatinasa están dados por la secuencia y la estructura que presenta el lazo que comprende desde la Ala-125 a la Pro-144 en la arginasa de hígado humano. Esta secuencia contribuye a la formación del sitio activo y contiene los residuos que unen el grupo alfa carboxilo de la arginina; los aminoácidos que forman este lazo y la estructura que estos adoptan determinarían la correcta ubicación de la red de puentes de hidrógeno que permite a la arginasa no sólo unir a la arginina, sino que ubicarla en una posición correcta para su hidrólisis. Algo equivalente ocurriría en el caso de la agmatinasa, que sólo reconoce e hidroliza a la agmatina. Específicamente, este trabajo de tesis doctoral tuvo los siguientes objetivos: (a) definir, mediante mutagénesis sitio dirigida, en la arginasa hepática humana, la participación de los xviii residuos Asn-130, Ser-137 y Asn-139 en la especificidad por la arginina; (b) generar especies quiméricas de arginasa de hígado humano, reemplazando los residuos I129 a P144 para el lazo A y P181 al L193 para el lazo B, por los correspondientes según el alineamiento aminoacídico con la agmatinasa de E. coli; (c) generar especies quiméricas de agmatinasa de E. coli reemplazando los residuos T154 al D162, para el lazo A y T188 al F190 para el lazo B, por los correspondientes en la arginasa hepática humana; (d) analizar las especies mutantes y quiméricas, mediante estudios cinéticos de velocidad inicial e inhibición por productos y análogos estructurales de los sustratos y los productos, de las respectivas reacciones de hidrólisis; (e) analizar la interacción de las enzimas con el metal y (f) analizar las propiedades estructurales de las especies quiméricas, incluyendo la determinación de los tamaños moleculares y análisis de sus propiedades espectrales mediante fluorescencia intrínseca de triptófanos. Los resultados obtenidos en este trabajo apoyan nuestra hipótesis respecto a la función del lazo A en la arginasa. Concretamente, hemos sido capaces de alterar la especificidad de la arginasa, al generar la especie quimérica que sólo es activa con agmatina como sustrato,por los reemplazos I129→T, N130→Y y T131→A junto a la eliminación de los residuos 132, 133 y 134, todos ellos presentes en el lazo donde están ubicados aquellos que unen el grupo alfa carboxilo de la arginina. De esta forma, concluimos que el lazo que interacciona con el grupo alfa carboxilo del sustrato sería determinante para de discriminar el tipo de sustrato que es susceptible de hidrólisis, además de ubicarlo en una posición correcta con respecto al ion hidroxilo que realizaría el ataque nucleofílico para generar la reacción de hidrólisis. En forma paralela, hemos encontrado una región crítica para la afinidad de la unión de la arginasa con la arginina, que corresponde al lazo donde se encuentran los residuos que interactúan con el grupo alfa amino de la arginina. Específicamente, luego del reemplazo conjunto de los residuos D181→T y V182→E se obtuvo una especie que mantuvo su valor de kcat prácticamente inalterado con un aumento muy significativo de la Km para arginina. Por otro lado, hemos analizado diversas especies quiméricas de la agmatinasa,modificando los residuos de ambos lazos por separado y en conjunto, mediante reemplazos equivalentes a los realizados en la arginasa. Sin embargo, todas las especies generadas sólo presentaron actividad con agmatina como sustrato. Los resultados obtenidos sugieren que, a diferencia de la arginasa, los lazos A y B no contribuirían en forma exclusiva a la especificidad de la agmatinasa, existiendo otras zonas que también contribuirían a la correcta localización de la agmatina para una hidrólisis eficiente en el sitio activo de la agmatinasa. Dado que estas regiones no fueron incluidas en nuestros experimentos, esto explicaría porqué alteraciones en el lazo A tienen efecto sobre la especificidad de sustrato de la arginasa, pero no de la agmatinasa.

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