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Actividad citotóxica de Lactobacillus fermentum UCO_979C sobre células de cáncer humanas
(Universidad de Concepción., 2018) Alarcón Zapata, Pedro Felipe; Zúñida Arbalti, Felipe; García Cancino, Apolinaria
Los probióticos son microorganismos vivos que, administrados adecuadamente, confieren beneficios al huésped. Actualmente, se han descrito propiedades quimiopreventivas, siendo capaces de reducir el riesgo de cáncer. El probiótico Lactobacillus fermentum UCO_979C, es capaz de inhibir a Helicobacter pylori, quien puede causar cáncer gástrico. El objetivo de este trabajo fue determinar la actividad citotóxica de L. fermentum UCO_979C y su lisado sobre células humanas normales y tumorales. Se evaluó la citotoxicidad a través de la técnica de Sulforrodamina B. Se observó citotoxicidad de la cepa UCO_97C con mayor sensibilidad células tumorales gastrointestinales AGS, CACO-2 y HCT-116, sin efecto citotóxico en células normales HUVEC. También, un análisis proteómico de su lisado bacteriano de la cepa UCO_979C presentó efectos citotóxicos en células de adenocarcinoma gástrico. En conclusión, la cepa probiótica de L. fermentum UCO_979C presenta actividad citotóxica en líneas celulares cancerígenas del tracto gastrointestinal, y también, en otras líneas celulares tumorales. Finalmente, existen productos intracelulares de L. fermentum UCO_979C con potencial citotóxico en células de cáncer gástrico. Se proyecta el uso del probiótico L. fermentum UCO_979C podría utilizarse para futuros ensayos relacionados en cáncer, tanto in vitro, como in vivo.
Análisis de la netosis en pacientes que padecieron COVID-19 y su asociación con alteraciones del perfil del metabolismo glucídico post infección.
(Universidad de Concepción., 2023) Cabrera García, Camilo Daniel; Nova Lamperti, Estefanía Andrea; Verdugo, Ricardo
The infectious Coronavirus disease 2019 (COVID-19) caused by the severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) was classified as a pandemic in 2020. Recent studies have shown that COVID-19 patients with poor prognosis exhibit high neutrophilia and develop more neutrophil extracellular trap formation (NETosis). In addition, diabetes and prediabetes have been described as risk factors for severe COVID-19 and glucose metabolism alterations have been reported to emerge after infection. Regulation of glucose metabolism is critical for neutrophil activation; however, it is unclear whether these alterations can affect neutrophil function after COVID-19. The aim of this study was to analyze NETosis in recovered COVID-19 patients who presents alterations in glucose metabolism 4 months post infection. Therefore, in a cohort of 60 patients who suffered COVID-19, we determined alterations in glucose metabolism 4 months after acute COVID-19. We then evaluated NETosis at baseline and in response to TLR3/7/8 agonists and the effect of patients' plasma on NETosis using a healthy neutrophil as a biosensor. The results revealed that 24 patients of the 36 (66,7%) patients who had no alterations in glucose metabolism at baseline developed insulin resistance (IR) 4 months post COVID-19. When NETosis was analyzed, it was observed that there is an increase in 3,5% baseline NETosis in neutrophils of patients who developed IR, which were not able to respond to TLR7/8 agonists but did respond to cytokines, compared to patients without alterations. In addition, we observed an increase in NETosis of healthy neutrophils exposed to plasma from post COVID-19 patients with IR compared to plasma from patients without IR, which was positively correlated with insulin and IL-6 present in plasma. In conclusion, there is an increased incidence of IR post COVID-19 in patients without previous alterations, who also presented increased basal NETosis, decreased capacity to respond to TLR 7 and increased capacity to induce NET formation in healthy neutrophils.
Análisis de los mecanismos protumorales de la bacteria periodontal Fusobacterium nucleatum sobre el crecimiento, transición epitelio mesenquimal y la expresión de marcadores inmunosupresores en línea celular de carcinoma oral de células escamosas.
(Universidad de Concepción, 2023) Muñoz Grez, Camila Paz; Nova Lamperti, Estefanía Andrea
El carcinoma oral de células escamosas (OSCC) es la manifestación más común del cáncer oral. Se ha propuesto que los patógenos periodontales participan en la progresión del OSCC, y data preliminar de nuestro laboratorio identificó mayor presencia de marcadores de Fusobacterium nucleatum (F.n) y epitelio de transición mesenquimal (ETM) en el secretoma de biopsias de pacientes con OSCC comparado con el de biopsias de pacientes sanos. Sin embargo, los mecanismos modulados por el bacterioma tumoral en OSCC aún no están completamente dilucidados. Se infectaron células cancerosas orales (HSC3) y células epiteliales normales (OKF6) con F.n (MOI100), para evaluar el efecto de la bacteria en el crecimiento tumoral, expresión de marcadores ETM y propiedades inmunomoduladoras. Después de la infección, confirmamos la presencia de la bacteria dentro y alrededor de las células cancerosas mediante microscopía confocal. En primer lugar, se encontró un incremento significativo en el tamaño de los esferoides tumorales infectados con F.n a los 3, 6 y 10 días después de la infección. En relación con los marcadores de EMT, la expresión transcripcional de MMP-9 se elevó significativamente en las células infectadas, mientras que la de E-cadherina disminuyó significativamente después de la infección. Además, mediante el kit Human XL Oncology encontramos aumento en la expresión de proteínas ETM como MMP-3, MMP-9 y FOXO1/FKHR, y disminución de proteínas como ICAM- 1, DLL-1 y ERB2 posterior a la infección con F.n. Finalmente, la expresión de Galectina-9 evaluada por citometría de flujo aumentó significativamente en las células cancerosas infectadas. A partir de esta evidencia proponemos que la bacteria periodontal F.n promueve la progresión tumoral de OSCC a través de un mayor crecimiento tumoral, adquisición de marcadores asociados a ETM y la regulación positiva de galactina-9.
Análisis del efecto de las quimioquinas CXCL9 y CXCL10 sobre la diferenciación in vitro de linfocitos B a células plasmáticas.
(Universidad de Concepción, 2023) Quiroga Sanzana, Romina Andrea; Nova-Lamperti, Estefanía; Colombo Flores, Alicia
La investigación sobre la producción de anticuerpos durante la infección por SARS-CoV-2 ha revelado diferencias en los niveles de IgG dependiendo de la gravedad de los síntomas. En pacientes chilenos, se observaron altos niveles de IgG anti-SARS-CoV-2 en aquellos experimentaron una forma grave de la enfermedad, caracterizada por el síndrome de distrés respiratorio agudo severo y la presencia de secuelas pulmonares estructurales tras la infección por COVID-19. Además, se ha observado que las citoquinas y quimioquinas desempeñan un papel relevante en la infección. En particular, CXCL9 y CXCL10 están elevadas en pacientes severos en lo que se conoce como la "tormenta de citoquinas". Datos preliminares sugieren una correlación positiva entre los niveles circulantes de CXCL9 y CXCL10 y los niveles de IgG anti-SARS-CoV-2. Sin embargo, no está claro si estas quimioquinas podrían estar contribuyendo a la exacerbación de la respuesta de anticuerpos observada en estos pacientes. Es importante destacar que CXCL9 y CXCL10 también se han encontrado en muchas otras enfermedades inflamatorias, y se ha demostrado que su receptor (CXCR3) se expresa en linfocitos B y en linfocitos TCD4+ que desempeñan un papel en la respuesta de anticuerpos dependiente de células T. El objetivo general de este proyecto es analizar el efecto in vitro de las quimioquinas CXCL9 y CXCL10 sobre la respuesta inmune humoral en linfocitos B y T helper provenientes de individuos sanos. Se implementó un sistema de cultivo de tres fases optimizado para la diferenciación de los linfocitos B in vitro que se evaluó en ausencia y presencia de CXCL9 o CXCL10, al igual que la activación in vitro de linfocitos T helper. Los cambios fenotípicos en ambas poblaciones se analizaron mediante citometría de flujo, mientras que producción de anticuerpos IgG totales se evaluó al término de protocolo mediante ELISA. La activación de las células B se confirmó con la regulación positiva de CD86 y CD25, mientras que la diferenciación de las células plasmáticas se confirmó con la presencia de células CD38hiCD27hi y CD138+. La expresión de CXCR3 también se reguló positivamente con el cóctel de activación utilizado en la fase 1 y se mantuvo durante la fase 2 y 3. En cuanto a la expresión de CD86, solo CXCL9 aumentó la expresión de este marcador, mientras que la presencia de CXCL9 y CXCL10 aumentó significativamente el porcentaje de células CD38hiCD27hi, células CD138+ y secreción de IgG. Finalmente, dentro del contexto de la inducción del cambio de clase de la célula B, observamos que CXCL9 también aumentó la expresión de CD40L en las células TCD4+. En resumen, demostramos que CXCL9 y CXCL10 podrían ser claves en la modulación de la respuesta humoral. A futuro, sería interesante determinar qué rutas de señalización utilizan estas quimioquinas para producir dicho efecto.
Análisis Molecular de los Transportadores de Vitamina C en Cáncer de Colon.
(Universidad de Concepción., 2012) Vergara Valenzuela, Marilyn Denisse; Rivas Rocco, Coralia
La vitamina C es un micronutriente esencial para el ser humano y debe adquirirse por medio de la dieta, ya que no puede ser sintetizada por el organismo porque existe una alteración en el gen que codifica para la enzima L-gulono-1,4-lactona oxidasa, importante en la etapa final de síntesis de esta vitamina. La Vitamina C es un potente antioxidante capaz de reducir tanto peróxido, hidroxilo, radicales superóxido y peroxinitrilo. También posee un rol como cofactor enzimático, por ejemplo en la biosíntesis de colágeno, carnitina y norepinefrina. La vitamina C es transportada al interior celular a través de dos sistemas de transporte, distintos y específicos para su forma reducida u oxidada respectivamente. La vitamina C oxidada, el ácido deshidroascórbico, es transportada por la familia de los transportadores facilitativos de glucosa, los GLUTs, los que se encuentran ampliamente distribuidos en mamíferos y comprenden 14 formas que presentan distinta distribución tisular y características funcionales. La vitamina C reducida, el ácido ascórbico, es transportada al interior celular por medio de transportadores acoplados a sodio, los SVCTs, con dos formas, SVCT1 y SVCT2, que presentan propiedades funcionales distintas y una distribución tisular y celular diferenciada. SVCT1 se expresa abundantemente en hígado, riñón e intestino, mientras que SVCT2 está más ampliamente distribuido y es expresado en riñón, intestino, cerebro, hueso y glándula adrenal, entre otros tejidos. Mucho se ha especulado sobre el rol que tendría la vitamina C sobre las células cancerígenas; distintos estudios evidencian su aporte en la prevención y tratamiento del cáncer, pero también se ha encontrado que niveles elevados de vitamina C tendrían un efecto dañino en el ADN. Sin duda, la concentración de vitamina C administrada es un -2- parámetro a considerar para poder establecer si la vitamina C efectivamente posee un rol protector frente al cáncer. El cáncer es la segunda causa de muerte a nivel mundial, y dentro de esto, el cáncer de colon y recto representa la segunda o tercera causa, dependiendo del sexo del paciente. En lo que respecta a Chile, el porcentaje de mortalidad por esta patología asciende al 9%, lo cual sin duda representa un problema emergente de salud pública. Existe evidencia indicando que existe un mayor contenido de vitamina C en tejido tumoral que en tejido normal, lo cual sugiere que podrían ocurrir cambios en el patrón de expresión de los transportadores de vitamina C, SVCT1 y SVCT2 en cáncer. Estas adaptaciones metabólicas estarían asociadas a un potencial redox aumentado como resultado de un aumento en la capacidad de las células tumorales para adquirir la vitamina C. En esta tesis se analizó si existen alteraciones en la expresión de los transportadores de vitamina C SVCT1 y SVCT2 en cáncer de colon, utilizando las técnicas de inmunohistoquímica e hibridación in situ. Basado en estudios preliminares, nuestra hipótesis de trabajo es que la progresión tumoral durante el desarrollo del cáncer de colon se ve acompañada de un aumento de la expresión del transportador de ácido ascórbico SVCT2. Para examinar la validez de esta hipótesis, lo primero que se realizó fue un estudio de expresión a nivel de proteína por inmunohistoquímica, utilizando anticuerpos policlonales con especificidad para SVCT1 o SVCT2. Posteriormente se elaboraron sondas de ARNm (sense y antisense) a partir de los correspondientes cDNA para SVCT1 y SVCT2 clonados en el laboratorio, sondas de elevada especificidad dirigidas contra la región de menor similitud de secuencia entre ambos transportadores. Una vez obtenidas las sondas, se cuantificaron y se utilizaron en primera instancia para estandarizar la técnica de ...
Asociación de las variantes genéticas FTO rs9939609 y TMEM18 rs6548238 con obesidad y riesgo metabólico en niños.
(Universidad de Concepción., 2011) Riffo Retamal, Teresa Benilde; Ulloa Muñoz, Natalia Verónica
La obesidad común es una enfermedad crónica de alta prevalencia en el mundo industrializado y ha sido declarada como pandemia por la OMS. Presenta una serie de comorbilidades como son, trastornos del metabolismo de hidratos de carbono (Resistencia a insulina), Diabetes Mellitus tipo 2 y Enfermedades Cardiovasculares, enfermedades que pueden llegar a disminuir la esperanza de vida hasta en 10 años y que representan un elevado costo económico. La prevalencia de esta enfermedad va en incremento y se presenta en etapas de la vida cada vez más tempranas, llegando a valores preocupantes en la población infantojuvenil. La principal característica de la obesidad es el cambio fenotípico del tejido adiposo, el cual tiene una importante actividad endocrina pues secreta una variedad de moléculas metabólicamente activas (adipoquinas) cuyo nivel de secreción se altera en los pacientes obesos. Así, las alteraciones en los niveles circulantes de estas adipoquinas están siendo aceptados como indicadores del riesgo metabólico del paciente obeso. La obesidad común se produce como resultante de la interacción de factores ambientales y factores genéticos. Los factores ambientales de riesgo más predominantes son la alimentación poco saludable y el sedentarismo. Los factores genéticos corresponden a una serie de polimorfismos que se asocian con mayor susceptibilidad a la obesidad común, de los cuales el polimorfismo más ampliamente estudiado es el rs9939609 del gen FTO (Fat Mas and Obesity Associated Gene), ubicado en el cromosoma 16 y más recientemente el rs6548238 del gen TMEM18 (Transmembrane Protein 18), ubicado en el cromosoma 2. Ambos polimorfismos son del tipo SNP o mutación simple. El objetivo del presente trabajo fue determinar la consecuencia de la presencia de las variantes genéticas rs9939609 del gen FTO y rs6548238 del gen TMEM18 sobre el estado nutricional, composición corporal e indicadores circulantes de riesgo metabólico, en una población escolar. Para esto se diseñó un estudio de tipo Casos y Controles, cuya muestra se obtuvo de una población escolar de niños de 6 a 11 años de edad de la comuna de Hualpén, región del Bio-Bio, Chile. Los casos fueron 238 niños obesos y el grupo control lo conformaron 136 niños eutróficos pareados por edad y sexo, ambos grupos seleccionados según determinados criterios de inclusión y exclusión, a partir de la población de interes de 2918 niños pertenecientes a escuelas municipales de Hualpén que cursaban entre 1º y 5º año básico. Los escolares fueron medidos y pesados y clasificados según su estado nutricional mediante criterio percentilar de IMC recomendado por el CDC. A cada niño se le determinó los indicadores de riesgo metabólico mediante metodos enzimáticos y ELISA según corresponda, y se genotipificaron para los polimorfismos FTO rs9939609 y TMEM18 rs6548238 mediante RT-PCR acoplado al sistema de High Resolution Melting (HRM). Los resultados demostraron que en nuestra población, mayoritariamente portadora de marcadores geneticos amerindios, 1) el polimorfismo rs9939609 del gen FTO se asoció con obesidad temprana (OR= 1.42 IC95% 1.07-1.89) calculado según el modelo aditivo, 2) este polimorfismo no varió con las diferentes categorias de peso al nacer, 3) el polimorfismo rs9939609 del gen se asoció con un deterioro de la sensibilidad insulínica adicional al ocasionado por la condición de obesidad, en población de sexo femenino desde la etapa pre-puberal. 4) La variante de riesgo rs6548238 del gen TMEM18 no mostró una significancia estadistica cuando fue asociada con obesidad. La falta de asociación del polimorfismo TMEM18 rs6548238, así como un posible efecto aditivo de ambas variantes genéticas sobre el puntaje z del IMC y sobre la cantidad de grasa corporal, podrían atribuirse a un tamaño muestral insuficiente. Aunque los resultados no alcanzaron significancia estadística, sugieren un efecto aditivo de las variantes de riesgo de FTO y TMEM18 sobre el puntaje z del IMC y el porcentaje de grasa corporal.
Caracterización de anticuerpos monoclonales anti apolipoproteína A-l para el reconocimiento de subpoblaciones de HDL.
(Universidad de Concepción., 2008) Lezana Díaz, Alejandra Marcela; Bustos Araya, Paula
La aterosclerosis es un desorden inflamatorio que conduce al desarrollo de la enfermedad coronaria, la que se caracteriza por una alteración de las lipoproteínas plasmáticas. Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) contienen apolipoproteína A-I (apo A-I), clave en el metabolismo del colesterol y responsable del rol antiaterogénico. En este trabajo se caracterizaron anticuerpos monoclonales (AcMos) anti apo A-I utilizando HDL total, HDL2, HDL3, pre-HDL, apo A-I nativa, apo A-I mutadas y péptidos de apo A-I. Los AcMos presentaron igual reactividad con apo A-I y HDL mediante ELISAs competitivos realizados en presencia de Tween-20. Al realizar estos ensayos en ausencia de Tween-20, los AcMos 2B4E9, 7C5E10 y 2C10 reaccionaron con la apo A-I y la HDL, en tanto los AcMos 1C11B7, 8A4 y 8A5 reaccionaron con la apo A-I en HDL y no con la apo A-I libre. La utilización de apo A-I con mutaciones puntuales en el extremo amino-terminal, demostró que los AcMos 2B4E9, 7C5E10, 2C10 y 6B9 reconocían epitopes de esta región. Los AcMos 1C11, 8A4, y 8A5 presentaron una elevada reactividad con líquido folicular humano, que contiene una alta concentración de preB-HDL. Por el contrario, los AcMos 2C10, 6B9 y 8B12G8 presentaron un bajo reconocimiento de las pre-HDL. Mediante la técnica del Biacore, se determinó una Kd (M) promedio de 10-9 para la interacción entre la apo A-I o HDL y los anticuerpos 1C11, 8A4, y 8A5, y de 10-8 para la interacción entre estos anticuerpos y una fracción del líquido folicular. La caracterización de los AcMos permitió la estandarización de dos ELISAs tipo sandwich. El primero desarrollado en presencia de tween-20 para la cuantificación de apo A-I total. El segundo se realizó en ausencia de tween-20 para la cuantificación de apo A-I en HDL. Se determinó apo A-I total y apo A-I en HDL en una muestra de 76 adolescentes obesos agrupados en base a la presencia o ausencia de síndrome metabólico, encontrándose una diferencia significativa tanto en los niveles de apo A-I total como de apo A-I en HDL entre los grupos con y sin SM. Se encontró una correlación altamente significativa entre la determinación de apo A-I por ELISA y la determinación de apo A-I realizada por turbidimetría.
Caracterización de especies de Fusarium aisladas de trigo nacional respecto a su capacidad micotoxigénica.
(Universidad de Concepción., 2015) Caro Jara, Noemí; Vega Herrera, Mario; Ríos Gajardo, Gisela
La fusariosis de la espiga es una de las enfermedades fúngicas más importantes que afectan los cultivos de trigo a nivel mundial. En Chile, no es común la ocurrencia de esta enfermedad, sin embargo, durante el ciclo agrícola 2012/13 en la provincia de Ñuble, Región del Bio Bio, se observó trigo candeal (Triticum turgidum) con sintomatología de fusariosis de la espiga. El objetivo de este trabajo fue aislar e identificar el hongo responsable de esta patología y evaluar si éste posee la capacidad de producir micotoxinas. Además de implementar una metodología analítica adecuada para el análisis de micotoxinas en trigo. El hongo aislado desde las glumas de las espigas con sintomatología de fusariosis de la espiga fue identificado morfológica y molecularmente como Fusarium graminearum. Utilizando un medio de arroz para la producción de micotoxinas in vitro, se determinó que el aislamiento de Fusarium graminearum tiene la capacidad de producir micotoxinas bajo las condiciones ensayadas. El aislamiento produce 15-ADON ˃ DON ˃ 3-ADON, lo que permite su clasificación en el quimiotipo 15-ADON. Se implementó una metodología analítica utilizando cromatografía de gas con detector de captura de electrones (GC-ECD) para el análisis de tricotecenos de tipo B (DON, 3-ADON, 15-ADON y NIV). La extracción de las micotoxinas se realizó utilizando acetonitrilo:agua (80:20, v/v). Los extractos se limpiaron utilizando columnas de extracción en fase sólida Bond Elut Mycotoxin. Posteriormente, se derivatizaron los extractos para obtener trimetilsilil derivados, los cuales se analizaron mediante GC-ECD. Con la metodología implementada se obtuvieron valores de recuperación promedio entre 50.1 – 110 % con una desviación estándar relativa inferior a 7 %. Los límites de detección y cuantificación se calcularon utilizando el método de señal:ruido, obteniéndose valores entre 10.0 – 14.5 μg kg-1
Caracterización de la respuesta inflamatoria periférica y central en un modelo de depresión inducido por un asilamiento social en hembras.
(Universidad de Concepción, 2024) Cepeda Barrales, María Yamila; Oyarce Merino, Karina; Elizondo Vega, Roberto
La depresión es un trastorno psiquiátrico que afecta profundamente la calidad de vida de las personas. A nivel mundial, 4,4% de la población padece esta afección, con mayor prevalencia entre las mujeres. Los conocimientos sobre las vías moleculares precisas que subyacen a la depresión aún no se han dilucidado por completo. Sin embargo, la evidencia acumulada a partir de estudios en roedores, donde se induce un comportamiento depresivo mediante estrés psicosocial, sugiere la participación de múltiples sistemas biológicos, incluidos el sistema neuroendocrino, el sistema inmunitario y los circuitos neurales. Evidencia reciente indica que la alteración en las respuestas inmunes periféricas y la neuroinflamación orquestada por la microglía están involucradas en la patogénesis de la depresión y podrían explicar la ineficacia del tratamiento convencional en un tercio de los pacientes. Lamentablemente, la mayoría de las observaciones provienen de modelos murinos de estrés en machos, aunque se sabe que existe dimorfismo sexual en la respuesta al estrés y la sintomatología depresiva. Por ello, el objetivo de este proyecto es evaluar el efecto del estrés por aislamiento social (AS) en la inflamación periférica y la neuroinflamación en ratones hembra. Se caracterizaron patrones conductuales asociados a comportamiento depresivo en ratones hembra sometidas a AS durante 7 semanas. Además, se evaluó la inflamación sistémica y la neuroinflamación a nivel del hipocampo, analizando distintas poblaciones celulares y la expresión de citoquinas pro y antiinflamatorias.
Caracterización de medio enriquecido derivado de células madres para favorecer la reparación tisular en un modelo de animal con hiperglicemia
(Universidad de Concepción., 2017) Ormazabal Valladares, Valeska Alejandra; Aguayo Tapia, Claudio Rodrigo
En los últimos años, se ha habido un aumento de diabetes mellitus, la Federación Internacional de Diabetes (FDI), señala que en el 2013, 382 millones de personas tiene diabetes y se espera que llegue a 592 millones en el 2035. Chile es el país con mayor prevalencia de Diabetes en américa del sur con un 12,32% de la población con Diabetes. La Diabetes tiene una alta morbimortalidad, se estima que entre un 15-25% de los pacientes con Diabetes desarrollan Úlcera de Pie Diabético en alguna de sus extremidades inferiores, de estos entre un 10-30% sufrirá además una amputación. En este contexto, se hace necesario la búsqueda de herramientas terapéuticas innovadoras que permitan tratar en forma eficiente la úlcera de pie diabético y garantizar su curación total. Por otro lado, las células madres Mesenquimales han sido objeto de debido a su alto potencial de diferenciación, proliferación, plasticidad, baja inmunogenicidad y fácil cultivo. Trabajos previos de nuestro laboratorio permitieron demostrar la capacidad de las células mesenquimales de diferenciarse a células endoteliales. Además demostramos que estás células endoteliales tenían la capacidad de inducir angiogénesis y de acelerar el cierre de heridas en un modelo in vivo. Asociado a estos hallazgos, se logró demostrar que el potencial de regeneración de las células endoteliales estaba en factores solubles secretados al medio de cultivo. Nos preguntamos: Los factores secretados por células endoteliales podrán inducir un mayor cierre de la herida en un modelo animal con hiperglicemia. Hipótesis: Factores angiogénicos secretados al medio de cultivo, por células endoteliales favorecen el proceso de regeneración tisular en un modelo animal con hiperglicemia, inducido por dieta. Objetivo General: Evaluar la capacidad de regeneración tisular del medio condicionado endotelial en un modelo de herida de animal con hiperglicemia, inducida por dieta, e identificar los factores solubles involucrados en este efecto. Para ello realizaremos ensayos de herida in vitro e in vivo utilizado un modelo animal de hiperglicemia inducido por dieta, además analizamos del medio de cultivo por array de factores secretados e isoelectroenfoque líquido acoplado a masa. Resultados: Nuestros resultados indican que el medio condicionado endotelial, incrementa la velocidad de cierre de la herida in vivo en un modelo animal con hiperglicemia inducida por dieta. Sin embargo en los ensayos in vitro el medio condicionado endotelial no logra inducir cierre de la herida. Los ensayos de proliferación celular in vitro muestran que el medio condicionado endotelial incrementa en un 30% la proliferación celular. Por otro lado utilizando ensayos de array e isoelectroenfoque liquido acoplado a masa, pudimos identificar factores solubles con potencial de ser los involucrados en el aumento del cierre de herida. Finalmente podemos concluir que no solo las células madres son responsables de su potencial en regeneración de tejidos, si no también los factores secretados por éstas.
Caracterización del mecanismo de defensa de estrés oxidativo en células endoteliales humanas expuestas al efecto del humo del tabaco.
(Universidad de Concepción., 2010) Salgado Mejías, Perla Katharinna Stephannia; Rivas Rocco, Coralia
El endotelio humano está constantemente expuesto a oxidantes intra y extracelulares, como los presentes en el humo de tabaco, ante los que se encuentra protegido por la acción de moléculas antioxidantes, tanto enzimáticas como no enzimáticas, de las cuales la vitamina C y el glutatión constituyen los componentes no enzimáticos más importantes. La vitamina C debe ser adquirida desde la dieta y es transportada al interior de la célula tanto en su forma reducida (ácido ascórbico) como en su forma oxidada (ácido deshidroascórbico), siendo acumulada intracelularmente como ácido ascórbico, alcanzando concentraciones de 0,1 - 5 mM. A diferencia de la vitamina C, el tripéptido glutatión (GSH, γ-glutamil-cistein-glicina) es sintetizado por todas las células, alcanzando concentraciones intracelulares de 0,5 a 10 mM, teniendo un papel fundamental en los procesos de detoxificación celular. Resultados iniciales obtenidos en nuestro laboratorio indican que el glutatión, y no la vitamina C, sería el antioxidante celular que determina la capacidad de células endoteliales humanas para sobrevivir al estrés oxidativo inducido por exposición a los compuestos tóxicos solubles presentes en el humo del tabaco. Tanto el contenido inicial de glutatión como la capacidad de las células para sintetizar el tripéptido de novo parecen ser fundamentales para una respuesta antioxidante efectiva. De acuerdo a lo anterior, en este proyecto proponemos que es posible aumentar la resistencia de células endoteliales humanas al efecto tóxico de los componentes solubles del humo del tabaco, modificando farmacológicamente el contenido y la síntesis de glutatión celular, en forma independiente del contenido de vitamina C. Para ello, estudiamos el efecto de la exposición de células endoteliales ECV-304 a medio de cultivo condicionado con humo de cigarro, en la presencia o en la ausencia del inhibidor de la síntesis de glutatión L-butionina-(S,R)-sulfoximina (BSO), del precursor de la síntesis de glutatión N-acetilcisteína, o de ácido ascórbico. Los objetivos desarrollados en este trabajo de tesis fueron: i) Establecer las condiciones experimentales para modificar en forma controlada y selectiva el contenido de glutatión de células endoteliales humanas. ii) Establecer el papel del contenido inicial de glutatión en la resistencia de las células ECV-304 al efecto tóxico de los componentes XI solubles del humo del cigarro. iii) Establecer el papel de la síntesis de novo de glutatión en la resistencia de las células ECV-304 al efecto tóxico de los componentes solubles del humo del cigarro. iv) Establecer que el contenido de vitamina C no altera el efecto de la modificación farmacológica del contenido y la síntesis del glutatión celular sobre la resistencia de las células endoteliales humanas al efecto tóxico de los componentes solubles del humo del cigarro. Aunque células endoteliales ECV-304 conteniendo glutatión sobreviven una exposición aguda y prolongada al humo del cigarro, células tratadas con BSO carentes de glutatión intracelular mueren rápidamente antes de completadas las 48 horas de cultivo. El tratamiento de las células endoteliales con N-acetilcisteína provocó un aumento del glutatión intracelular por un mecanismo que involucra la síntesis de novo de glutatión intracelular, ejerciendo un potente efecto protector contra el daño oxidativo producido por el humo del cigarro. En contraste, la vitamina C no tiene efecto protector del daño producido por estrés oxidativo inducido por el humo del cigarro en las células endoteliales ECV-304. Nuestros resultados demuestran que es posible aumentar la resistencia de células endoteliales humanas al efecto tóxico de los componentes solubles del humo del tabaco, modificando farmacológicamente el contenido y la síntesis de glutatión celular, en forma independiente del contenido de vitamina C.
Caracterización del sistema oxitocinérgico y tiroideo en explantes placentarios humanos según tipo de parto.
(Universidad de Concepción, 2023) Appel Rubio, Javiera Ignacia; Guzmán Gutiérrez, Enrique Alberto
Introducción: La Oxitocina y la L-Tiroxina son dos hormonas fundamentales durante el embarazo y el parto. Existe evidencia de un incremento de ambas hormonas y de sus respectivos receptores de membrana expresados en placenta, conforme avanza la gestación. Y, además, existen diferencias en los niveles hormonales de acuerdo con el tipo de parto cursado. Sin embargo, su función y mecanismos de señalización en el tejido placentario aún son desconocidos. El objetivo general de esta investigación fue caracterizar el sistema oxitocinérgico y tiroideo en explantes placentarios humanos según el tipo de parto. Metodología: A partir de placentas clasificadas según tipo de parto, se prepararon explantes placentarios humanos a los que se les administró, por un lado, oxitocina a dosis crecientes (0 a 109 M), Se evaluó la expresión de OXTR por medio de inmunohistoquímica y, la expresión del efector eEF2 por medio de Western Blot. Mientras que, por otro lado, a los explantes placentarios se les administró tiroxina 2 pM, y posteriormente se les evaluó la expresión de sus posibles efectores, tanto de las vías genómicas, como no genómicas, END-1 y HIF-1ɑ, respectivamente. Los datos fueron analizados por Mann-Whitney, t-test o ANOVA, considerando significancia valor p<0,05. Resultados: En parto espontáneo disminuye la expresión de OXTR, conforme aumenta la concentración de oxitocina hasta alcanzar los 1nM, luego de ello la expresión de OXTR se mantendría elevada. En cambio, en partos de tipo acelerado, la expresión de OXTR se mantiene elevada a dosis crecientes de oxitocina. La expresión de OXTR en cesáreas presenta una tendencia a la disminución conforme aumenta la concentración de oxitocina. En parto espontáneo eEF2 se encuentra completamente inactivado a diferencia de los demás tipos de parto. En cuanto al sistema tiroideo, se observó que los explantes placentarios provenientes de parto acelerado presentan una mayor expresión de mRNA de END-1. También se observó que la exposición de L-tiroxina induce la expresión de END-1 en parto espontáneo y cesárea de urgencia. Mientras que no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la expresión de mRNA de HIF-1ɑ por tipo de parto ni frente a exposición de L-tiroxina. Conclusiones: Los tipos de parto presentan diferencias en la expresión del receptor y señalización del sistema oxitocinérgico y tiroideo, en placentas humanas. Esta diferencia se observa de manera basal y también, en respuesta a la exposición de oxitocina y L-tiroxina. Para el sistema oxitocinérgico, el tejido proveniente de parto espontáneo sería sensible a los cambios de oxitocina dentro de los rangos fisiológicos, mientras que en rangos suprafisiológicos OXTR se desensibiliza e inactiva la ruta de señalización, aumentado la fosforilación de eEF2. Mientras que, en el sistema tiroideo, los resultados sugieren que existe activación exclusiva de la vía de señalización genómica, la cual se activa diferenciadamente según tipo de parto. Esta es la primera investigación que evalúa ambos sistemas de señalización en placenta humana.
Caracterización del transporte de adenosina en células progenitoras de endotelio humano.
(Universidad de Concepción., 2010) Guzmán Gutiérrez, Enrique Alberto; Aguayo Tapia, Claudio Rodrigo
Las células progenitoras endoteliales (EPC) son células derivadas de la médula ósea, que pueden proliferar y diferenciarse en células endoteliales maduras. En esta diferenciación participa el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), el cual es liberado en condiciones de hipoxia, siendo regulado por la concentración extracelular de adenosina. Este nucleósido, actúa como un agente protector en condiciones de isquemia, mediante la activación de receptores de membrana, es por esto que las células cuentan con sistemas transportadores que regulan la concentración extracelular de adenosina. Los transportadores de nucleósidos se clasifican en dos grandes familias: i. Transportadores de nucleósidos equilibrativos (ENT), los cuales se subdividen de acuerdo a su sensibilidad a Nitrobenciltioinosina (NBTI); ii. Transportadores de nucleósidos concentrativos (CNT), los cuales son dependientes de sodio, y se subdividen de acuerdo a los tipos de nucleósidos transportados. No existen estudios que demuestren la expresión de transportadores de nucleosidos en células madres humanas adultas. Es por esto que, el objetivo general de esta tesis es: Caracterizar el transporte de adenosina y expresión de transportadores de nucleosidos (NT) en células progenitoras endoteliales humanas y determinar el efecto de la diferenciación sobre la expresión de NT. Nuestros resultados demuestran que las células progenitoras endoteliales (hEPCs) expresan los sistemas hENT1 y hCNT3 funcionales, pero no hENT-2, hCNT1, y hCNT2, en las diferentes etapas de diferenciación. El transporte de nucleósidos equilibrativo fue inhibido por NBTI en hEPC cultivadas por 3 días (hEPC-3d), pero solo parcialmente reducido a los 14 días de cultivo (hEPC-14d). 10 Los niveles de proteína y mRNA para hENT-1 disminuyen en hEPC-14d comparado con hEPC-3d, pero los niveles de mRNA para hCNT3 aumentan en hEPC-14d. Además, se demostró un incremento de la expresión de marcadores endoteliales, asociado a una disminución en la expresión de marcadores de células madres indiferenciadas en las etapas de cultivo estudiadas. En hEPC-3d, el transporte de adenosina mediado por hENT-1 fue saturable e independiente de sodio, mientras que en hEPC-14d el transporte de adenosina fue insensible a NBTI, semi-saturable, y mediado por dos componentes de transporte. El componente 1, de alta afinidad fue independiente de sodio e inhibido por NBTI, característico de un transportador tipo hENT1; y el componente 2, baja afinidad, no inhibido por NBTI, dependiente de sodio, y de la concentración de protones (pH) y posee una estequiometría sodio-adenosina de 2 : 1, todo lo cual sugiere la presencia de un transportador tipo hCNT3. Estos resultados representan las primeras evidencias que demuestran que células progenitoras endoteliales humanas transportan adenosina principalmente mediado por hENT-1, cuya actividad disminuye en hEPC-14d. Pero además, en hEPC-14d, existe un aumento en la expresión y actividad del transportador dependiente de Na+ , compatible con sistema tipo hCNT3. Estos resultados permiten sugerir que cambios en el estado de diferenciación de EPC hacia un fenotipo endotelial, podría asociarse con cambios en el patrón de expresión de transportadores de nucleósidos.
Caracterización fenotípica y funcional de células endoteliales transdiferenciadas desde células Mesenquimales aisladas de gelatina de Wharton humana.
(Universidad de Concepción., 2013) Aguilera Rudolph, Valeria Constanza; Aguayo Tapia, Claudio Rodrigo
Las células madres adultas han generado enormes expectativas en el contexto de la medicina regenerativa, especialmente las células madres mesenquimales (MSCs) las cuales son muy atractivas debido a su alto potencial de diferenciación, proliferación, plasticidad, baja inmunogenicidad y fácil cultivo, convirtiéndolas en una excelente fuente celular para la reparación de tejidos. Recientemente, se ha descrito que las MSCs aisladas de médula ósea, poseen la capacidad de transdiferenciarse hacia células con fenotipo endotelial, siendo capaces de migrar y participar en la neovascularización del tejido con injuria. Sin embargo, la médula ósea como fuente de aislamiento de MSCs, presenta limitaciones importantes, por esto, se han buscado fuentes alternativas para obtención de estas células, dentro de estas la gelatina de Wharton de cordón umbilical es considerada una excelente fuente de MSCs con alta capacidad de proliferación y de baja inmunogenicidad, ya que, no expresan antígenos del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Recientemente, se ha descrito que las MSCs aisladas de gelatina de Wharton humana (hWMSCs) pueden transdiferenciarse hacia células con fenotipo endotelial in vitro, pero no se ha demostrado su capacidad para sintetizar óxido nítrico y su contribución en procesos de neovascularización in vivo. El objetivo de esta tesis es evaluar en un modelo de ratón la capacidad angiogénica de células con fenotipo endotelial transdiferenciadas a partir de células mesenquimales provenientes de gelatina de Wharton humana. Para esto, en esta tesis se aislaron y cultivaron MSCs de gelatina de Wharton humana y se transdiferenciaron a células con fenotipo endotelial, posteriormente fueron caracterizadas morfológica, fenotípica y funcionalmente, mediante la evaluación de la expresión de marcadores endoteliales y la actividad de sintasa de óxido nítrico endotelial (eNOS), además se determinó la capacidad de formar estructuras tubulares en Matrigel in vitro y regeneración de lesiones tisular in vivo. En este trabajo se logró aislar células mesenquimales desde gelatina de Wharton humana, las cuales cumplen con todos los criterios estipulados por la Sociedad internacional de terapia celular (ISCT) para definir a una célula mesenquimal como tal. Las hWMSCs son capaces de diferenciarse hacia adipocitos, osteocitos y condrocitos 11 además expresan los marcadores mesenquimales CD90, CD73 y CD105. Las hWMSCs son capaces de transdiferenciarse hacia células con fenotipo endotelial (hWMSCs endotelial). Las hWMSCs-endotelial expresan los marcadores endoteliales CD31 y KDR. Los ensayos de conversión de L-[3H]arginina a L-[3H]citrulina, muestran que la formación de L-citrulina es mayor en hWMSCs-endoteliales 30 días en comparación a hWMSCs endoteliales 14 días y hWMSCs. Esto resultados son coherentes con un aumento significativo en la biodisponibilidad de óxido nítrico en hWMSCs-endoteliales de 14 y 30 días en relación a hWMSCs, sugiriendo que a medida que las células hWMSCs se transdiferencian hacia un fenotipo endotelial, la síntesis de óxido nítrico (NO) aumenta. Por otro lado, los estudios en el modelo de neovascularización in vivo, indica que los animales tratados con hWMSCs-endoteliales presentan mayor score histológico, número y área de vasos sanguíneos en comparación con ratones tratados con hWMSCs. Finalmente, ensayos de inmunohistoquímica muestran que las hWMSCs, pero en mayor medida hWMSCs-endoteliales 30 días se incorporan al tejido de cicatrización sugiriendo que el efecto tisular es mediado por las células implantadas o por los factores producidos por las células. Nuestros resultados representan las primeras evidencias que demuestras que las células mesenquimales aisladas de gelatina de Wharton humana son capaces de transdiferenciarse a células con fenotipo endotelial (hWMSCs-endoteliales) con capacidad de sintetizar óxido nítrico y de favorecer procesos de neovascularización in vivo en modelo de ratón.
Comparación del perfil farmacocinético de dos esquemas de administración oral de metronidazol en voluntarios sanos.
(Universidad de Concepción., 2014) Morales León, Felipe Eduardo; Von Plessing Rossel, Carlos
Las infecciones anaeróbicas constituyen una causa común de enfermedades potencialmente severas y con una elevada mortalidad. Frecuentemente son causadas por bacterias anaeróbicas del genero Peptostreptococcus spp. y Bacteroides spp. Por su parte, el metronidazol (MTZ) es considerado el antibiótico de elección para el manejo de estos cuadros; sin embargo, su administración requiere de dosis múltiples diarias provocando falta de adherencia al tratamiento, aumento de errores de medicación e incidencia de efectos adversos severos entre otras consecuencias. Debido al elevado efecto post antibiótico en conjunto con la rápida actividad bactericida, concentración dependiente de MTZ, es que la administración de ene antibiótico en una dosis inferior y en intervalo ampliado, permitiría alcanzar parámetros PK/PD comparables. De tal forma, se realizó un ensayo clínico controlado, cruzado, aleatorio simple sobre un grupo de voluntarios adultos sanos quienes recibieron la administración oral de una única dosis de MTZ de 500 mg cada 8 horas.
Contribución de los receptores de adenosina en células progenitoras endoteliales al proceso de angiogénesis.
(Universidad de Concepción., 2019) Oporto Palma, Katherine Alejandra; Aguayo Tapia, Claudio Rodrigo
Las células progenitoras endoteliales (EPC) son un tipo de células madres adultas que se localizan en la médula ósea y en sangre periférica y tienen la capacidad de diferenciarse en endotelio adquiriendo sus marcadores de superficie característicos. Las EPC se han visto involucradas en procesos de angiogénesis y proliferación celular mediados por la activación del receptor 2 para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), promoviendo la movilización tanto de las células endoteliales maduras como de EPC desde médula ósea o sangre periférica hacia el sitio de isquemia e hipoxia. Se han descrito dos poblaciones de células progenitoras endoteliales humanas (hEPC), las tempranas y tardías. Las hEPC tempranas se caracterizan por su capacidad para secretar factores angiogénicos que estimulan la formación de nuevos vasos sanguíneos, mientras que las hEPC tardías poseen un fenotipo endotelial y se caracterizan por su capacidad para formar vasos sanguíneos. Por otra parte, en condiciones de hipoxia e isquemia, no sólo ocurre proliferación y migración de EPC, si no también liberación de adenosina y la activación de sus receptores los cuales modulan la respuesta isquémica. El nucleósido adenosina cumple un rol cardio protector, ya que participa activamente en la regulación de procesos de angiogénesis y vasculogénesis. Además, está involucrada en otros procesos como la modulación del sistema inmune, vasodilatación, regulación del flujo sanguíneo y la oxigenación de los tejidos. Estos fenómenos ocurren en el microambiente de los tejidos de acuerdo a las necesidades metabólicas locales y dependen de la activación de una serie de receptores de membrana asociados a proteína G. A la fecha se han reportado 4 tipos de receptores, denominados A1, A2A, A2B y A3. Resultados previos demuestran el efecto de adenosina sobre la migración y movilización de EPC y además, sugieren que este nucleósido podría modular la capacidad angiogénica de las EPC. Sin embargo, se desconoce el mecanismo mediante el cual adenosina podría modular la capacidad angiogénica de las EPC, se sugiere que la secreción de VEGF y/o liberación de exosomas podrían contribuir en este proceso. En esta tesis se ha establecido que las células progenitoras endoteliales de tres días de cultivo (hEPC-3d) responde a NECA (activador general de los receptores de adenosina) favoreciendo la liberación del factor angiongenico VEGF, que contribuye a la formación de estructuras capilares. Además, se han aislado y caracterizado parcialmente las microvesículas secretadas por las EPC y en respuesta a activadores de los receptor de adenosina. También, se ha demostrado que las microvesículas contribuyen a la formación de estructuras tipo capilares in vitro y aumentan la capacidad de proliferación de las células ECV-304. Estos resultados son la primera evidencia que demuestra la interrelación entre adenosina y hEPC, puesto que ambos componentes poseen roles centrales en los procesos de vaso regeneración en el organismo. En base a los resultados se puede establecer que adenosina modula la función de las hEPC-3d mediante .
Desarrollo de formulaciones cosméticas a base de extractos de hojas de Ugni molinae Turcz (Murtilla) enriquecidos con triterpenos de la especie, con efecto reductor del Fibroedema geloide mucoso subcutáneo “Piel de naranja”.
(Universidad de Concepción., 2019) Camacho Benalcázar, Maira Carolina; Avello Lorca, Marcia Andrea
La presente investigación tiene como objetivo desarrollar formulaciones cosméticas a base de extractos hidrofílicos de hojas de Ugni molinae Turcz(Murtilla) enriquecidos con triterpenos de la especie, con efecto reductor del fibroedema geloide mucoso subcutáneo (piel de naranja) grado 3. Se realizó un análisis taxonómico a la planta, en la droga cruda se identificaron cuantitativamente los compuestos químicos de la especie botánica ejecutando un tamizaje fitoquímico a los extractos obtenidos por maceración. El presente proyecto es innovador e interesante puesto que los extractos se fraccionaron por cromatografía en contracorriente verdadera (True Moving Bed, TMB), para extraer los compuestos triterpénicos presuntos responsables del efecto dermocosmético, lo que sin lugar a dudas crea un valor agregado en el producto. Los extractos originales fueron enriquecidos con diferentes porcentajes de la fracción triterpénica obtenida por TMB con el fin de potenciar su efecto, además dichos extractos también fueron enriquecidos con extractos de otra fuente vegetal que ya ha demostrado su efecto para disminuir el FGMS. Estos extractos fueron incluidos en bases cosméticas las que fueron caracterizadas fisicoquímicamente y sometidas a estudios biológicos in vitro y en humanos para evaluar su efectividad y seguridad. Finalmente, fueron seleccionados los extractos y formulaciones más activas y seguras.
Desarrollo de geles a base de quitosano para su aplicación en lesiones cutáneas.
(Universidad de Concepción., 2006) Fernández Escobar, Marcos Mauricio; Plessing Rossel, Carlos von
El objetivo de este trabajo fue formular y preparar geles a base de quitosano con sulfadiazina de plata y estudiar su aplicación en el tratamiento de heridas cutáneas de diversa etiología. Se formularon geles de quitosano de peso molecular bajo (Mv=72.180 g/mol) con un 92% de desacetilación y peso molecular medio (Mv=103.200 g/mol) con un 97% de desacetilación, ambos a una concentración de 4% p/p. Los geles fueron caracterizados por FT-IR, microscopia electrónica de barrido y análisis reológico. Se evaluó la estabilidad física y química de las formulaciones preparadas, a través de un estudio de estabilidad bajo dos condiciones de almacenamiento: 20±3°C y 40°C/75% HR por un periodo de 90 días. Se evaluó la actividad antimicrobiana in vitro de las formulaciones preparadas y la eficacia de los geles para contribuir a la regeneración tisular en heridas provocadas en ratas. En el estudio espectroscópico, ambos geles no presentaron diferencias en sus espectrogramas FT-IR. El estudio reológico arrojó que el gel de quitosano de peso molecular bajo, presentó un flujo pseuplástico, y el quitosano de peso molecular medio un flujo plástico, ambos sin tixotropía. A partir de los geles anteriormente caracterizados se formularon y elaboraron preparados semisólidos a base de quitosano de peso molecular alto y bajo al 4% con y sin sulfadiazina de plata al 1 %. Los semisólidos fueron estables física y químicamente durante un periodo de 90 días cuando se almacenaron a 20± 3°C. Las formulaciones almacenadas a 40°C y 75 % de humedad relativa presentaron estabilidad variable durante los 90 días de almacenamiento. La caracterización reológica reveló que todas las formulaciones estudiadas presentaron un flujo plástico con diferentes grados de tixotropía. Los valores de rendimiento fueron los adecuados para permitir una fácil extracción del preparado desde el envase y evitar su escurrimiento cuando el semisólido es aplicado sobre una superficie. Los geles compuestos por quitosano al 4% y sulfadiazina al 1% presentaron una mayor actividad antibacteriana y antifúngica que el Platsul-A®. La aplicación del gel de quitosano al 4% en heridas cutáneas en ratas provocaron una recuperación más rápida de éstas comparado al gel quitosano al 4%+sulfadiazina de plata y Platsul-A®.
Desarrollo de micropartículas biodegradables de metilprednisolona por secado por atomización para su administración en patologías de disfunción articular.
(Universidad de Concepción., 2012) Tobar Grande, Blanca Sofía; Gómez Gaete, Carolina Pilar
El objetivo de esta investigación consistió en desarrollar micropartículas biodegradables de metilprednisolona por secado por atomización, como sistema de liberación controlada para su eventual administración en patologías de disfunción articular. Inicialmente se elaboraron partículas a partir de dos formulaciones de mezclas de excipientes biocompatibles, determinando la matriz más apropiada, que consistió en una mezcla de albúmina/condroitina sulfato/hialuronato de sodio al 10, 56.7 y 33.3% respectivamente. A partir de esta formulación se elaboraron micropartículas cargadas con diferente concentración de metilprednisolona base: 0.73, 1.64 y 9.1% p/p. Mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) se demostró que las micropartículas eran prácticamente esféricas, cuya superficie se tornaba rugosa a medida que se incrementaba la carga de metilprednisolona en la formulación, esta variable influyó directamente disminuyendo el diámetro medio y el potencial zeta de las micropartículas. Además se observó mediante XRD, DSC y TGA la interacción entre los excipientes de la formulación, demostrando en las micropartículas cargadas, la reducida presencia de metilprednisolona base al estado cristalino. Se obtuvo, en todas micropartículas cargadas, una eficiencia de encapsulación superior al 89%. La cinética de liberación efectuada in vitro en condiciones sink, fue dependiente de la concentración de metilprednisolona base presente en las micropartículas, retardando su liberación a medida se aumentó la concentración de principio activo en la formulación. Sin embargo, al ser comparadas con la cinética de liberación de DEPO-MEDROLM.R. (suspensión inyectable 40 mg/mL de metilprednisolona acetato), todas las micropartículas cargadas liberaron el principio activo de manera más rápida. Finalmente se evaluó la toxicidad in vitro en células THP-1, demostrando que ninguna de las micropartículas elaboradas promueve la respuesta inflamatoria mediante la liberación de IL-1β y que no afectan la viabilidad celular; excepto, con la formulación al 9.1% p/p, cuando la concentración en los cultivos celulares era extrema, resultado similar a lo obtenido por DEPO-MEDROLM.R. bajo las mismas condiciones de ensayo. Por tanto, las micropartículas obtenidas, presentan reales potencialidades que orientan a continuar con estudios in vivo y/o evaluar su potencial administración.
Desarrollo de superficies electródicas de última generación para el diseño de biosensores electroquímicos nanoestructurados para la determinación de moléculas bioactivas de relevancia actual en el área farmaceútica y clínica.
(Universidad de Concepción., 2012) Mundaca Uribe, Rodolfo Andrés; Peña Farfal, Carlos
Androsterona es un esteroide anabólico androgénico, y es considerado una sustancia de dopaje por el Comité Olímpico Internacional (COI). Por esta razón la detección de andrógenos y esteroides anabólicos se ha convertido en el mayor objetivo del análisis en dopaje, desarrollándose distintas metodologías para la determinación de sustancias dopantes en muestras biológicas, siendo éste el principal objetivo del trabajo. En este trabajo se ha desarrollado un biosensor enzimático basado en la enzima 3αhidroxiesteroide deshidrogenasa de Pseudomona testosteroni H1506 (Sigma), con una matriz compósita compuesta por líquido iónico n-octilpiridinio hexafluorofosfato (Io-Li-Tec), NAD+ (Gerbu) y Nanotubos de carbono de multipared (Nanolab). Las determinaciones se han realizado por medio de amperometría usando un detector amperométrico InBea Biosensores SL. Para el desarrollo del biosensor se llevó a cabo la inmovilización de la enzima 3αhidroxiesteroide deshidrogenasa (3α-HSD) en una superficie electródica compósita, constituida por una mezcla de nanotubos de carbono de multipared (MWCNTs), líquido iónico octilpiridinio hexafluorofosfato (OPPF6) y NAD+ como cofactor enzimático. Esta configuración permitió la determinación electroquímica rápida, sensible y estable del NADH generado en la siguiente reacción enzimática: Androsterona + NAD+ → 5α-androstano + NADH, catalizada por la enzima mencionada. Todas las variables involucradas en el desarrollo de la metodología fueron optimizadas. Se realizó amperometría a E = 0,4 V en agitación y se obtuvieron curvas de calibrado lineales para androsterona, en el rango de concentración de 0,5 a 10 µM, con un valor de pendiente doscientas veces mayor que otros métodos previamente reportados (2, 3). El límite de detección obtenido fue de 0,15 µM. El biosensor desarrollado puede ser aplicado en la determinación de androsterona en suero humano, obteniéndose resultados adecuados, concluyendo que es un método válido para la determinación de androsterona en el control anti dopaje