Tesis Magíster
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Browsing Tesis Magíster by Author "Aguilera Muñoz, Felipe Eleander"
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Item Estudio funcional de Ric-8A/Gαq en la formación del mesodermo dorsal en Xenopus tropicalis.(Universidad de Concepción, 2024) Ruíz Norambuena, María José; Torrejón Quezada, Marcela Eliana; Aguilera Muñoz, Felipe EleanderLa cresta neural (CN) es un tejido embrionario pluripotencial, transitorio y característico en vertebrados, que es inducido en el borde de la placa neural y puede diferenciarse a distintos tejidos. Para su inducción y mantención, requiere de señales provenientes del mesodermo dorsal, ectodermo neural y no neural, que permiten su desarrollo y posterior migración a lo largo del embrión. Se ha descrito que tanto la proteína Ric-8A como Gαq se expresan en tejido de CN y mesodermo dorsal. Además, resultados previos evidencian que, tanto Ric-8A como Gαq son necesarios para la correcta inducción de la CN, así como también que Gαq se encuentra regulando a la vía Wnt en el mesodermo dorsal, tejido donde se encuentra el organizador de Spemann-Mangold, lo que nos permitió asociar todas estas proteínas con la formación del mesodermo y con ello presentar nuestra hipótesis de trabajo “La señalización mediada por Ric-8A/Gαq regula la formación del mesodermo dorsal necesaria para la correcta inducción de la cresta neural en conjunto con otras vías de señalización involucradas, en Xenopus tropicalis”. Para responder a ésta, se realizaron ensayos de pérdida y ganancia de función, tanto de Ric-8A como Gαq, en los cuales se determinó que el silenciamiento de ambas proteínas inhibe la expresión del marcador de CN snail2, por lo que ambas proteínas estarían regulando la inducción de CN. El análisis, por medio de hibridación in situ, de la expresión de los marcadores de mesodermo (chordin, goosecoid, xbra) y de ectodermo queratina xk81a1 al silenciar a Ric-8A, evidencia la inhibición de la expresión de chordin y goosecoid, sin embargo, al realizar el análisis por medio de RT-qPCR, disminuye la expresión de goosecoid, mientras que la expresión de queratina aumenta, sugiriendo que Ric-8A regula la formación del mesodermo y ectodermo no neural. Por otro lado, el silenciamiento de Gαq evidenció la inhibición de la expresión de goosecoid y xbra, al emplear ambas técnicas, sugiriendo que Gαq regula la formación del mesodermo. Ensayos de epistasis del silenciamiento de Ric-8A con Gαq, mostraron que Gαq rescata el fenotipo anormal observado, indicando que ambas proteínas estarían en la misma vía de señalización regulando la formación del mesodermo. Ensayos de recombinación de tejidos también respaldan que la vía de señalización Ric-8A/Gαq es necesaria en la inducción de CN, específicamente en la zona marginal dorso-lateral del mesodermo, ya que al silenciar estas proteínas en dicho tejido, se inhibe la inducción de la CN. Además, la expresión del marcador neural sox2 también se ve afectada al inhibir la expresión de Ric-8A y Gαq, sugiriendo que ambas proteínas, además, estarían regulando la formación del ectodermo neural. Ensayos realizados con el fin de determinar si otra subunidad Gα pudiera estar involucrada en el efecto observado con la disminución de los niveles de Ric-8A, muestran que Gαi2 no estaría involucrada. Finalmente, análisis bioinformáticos de expresión diferencial de genes empleando secuencias de ARN-seq de Zona Marginal Dorsal y CN, en conjunto con análisis de enriquecimiento de términos GO, evidencian la importancia de procesos biológicos asociados al desarrollo de tejidos, migración celular y regulación de vías de señalización como Wnt y BMP en estos tejidos. Además, empleando el programa STRING se comprobó que proteínas pertenecientes a la vía de señalización de proteína G heterotrimérica están presentes en la zona marginal dorsal, región correspondiente al organizador de Spemann-Mangold, y CN, en conjunto con proteínas de la vía Wnt, FGF, BMP, y Hedgehog. Todos estos resultados en conjunto nos permiten sugerir que la señalización de Ric-8A/Gαq regula la correcta formación del mesodermo dorsal, ectodermo neural y no neural, necesarias para la inducción de la CN, en conjunto con otras vías de señalización.