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Generación de embriones bovinos por transferencia nuclear somática: evaluación de la capacidad de desarrollo in vivo e in vitro y de la expresión génica en las etapas pre y peri-implantatorias
(Universidad de Concepción., 2009) Rodríguez Alvarez, Lleretny; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
La clonación somática es una poderosa herramienta para la producción de animales con un genotipo específico, ya sea para fines productivos a través de la multiplicación de ejemplares de alto valor genético, la creación de animales transgénicos o para la conservación de especies en peligro de extinción. En la última década esta tecnología se ha ido perfeccionando y hoy en día se ha logrado la obtención de clones en dieciséis especies de mamíferos. La aplicación de la transferencia nuclear es limitada debido a la ineficiencia del proceso en término de animales nacidos y al desconocimiento de la expresión génica que gobierna el proceso de clonación, por lo que es sujeto de estudio a nivel mundial. En este trabajo se empleó una metodología novedosa de transferencia nuclear somática, conocida como Hand Made Cloning (HMC) para generar embriones bovinos clonados, usando dos líneas celulares distintas como donantes de núcleo, una de fibroblastos de piel de un animal adulto y la otra de un feto. Se evaluó el potencial de desarrollo de los embriones generados con ambas líneas, en términos de desarrollo in vitro hasta blastocistos, así como morfología y calidad. Se demostró que con la línea celular adulta es posible generar con mayor eficiencia y calidad embriones clonados en bovinos. Para caracterizar la expresión génica en blastocistos (etapa peri-implantatoria) generados a partir de ambas líneas se empleó PCR tiempo final y real y se comparó ésta con los patrones de expresión de embriones producidos mediante fecundación in vitro (FIV). Se estudiaron los patrones de expresión de genes cruciales para el desarrollo embrionario, concluyendo que los mismos son diferentes entre las líneas celulares y entre éstas y los embriones de FIV. Los patrones de expresión génica de los embriones producidos con la línea celular adulta fueron más parecidos a los de los controles, por ello y por el mayor potencial de desarrollo hasta blastocistos de calidad, se seleccionó esta línea para la producción de embriones elongados (día 17) y de clones a términos. Se transfirieron a hembras receptoras embriones clonados producidos a partir de la línea celular adulta, así como controles producidos por FIV y se recolectaron al día 17. A partir de estos embriones, se estudiaron los patrones de expresión génica por técnicas de PCR tanto a tiempo real como final de los embriones elongados (etapa peri-implantatoria) clonados y de FIV, siendo diferencial la expresión entre ambos y ésta a su vez diferente con respecto a los blastocistos de día 7, tanto para FIV como para los clones. Estos hallazgos, así como la cuantificación de los niveles de expresión de algunos genes cruciales para el desarrollo embrionario temprano, constituyen los primeros reportes de su tipo en la literatura del tema. Adicionalmente se estudió a nivel global, la expresión génica en embriones clonados a partir de células adultas y producidos por FIV, mediante microarreglos, se encontraron más de mil genes expresados en ambos grupos y de éstos alrededor del 4% se encontró diferencialmente expresado (hiper o hipo expresión) en los embriones clonados. Los datos del microarreglo fueron validados por PCR cuantitativo (PCR tiempo real), lo cual a su vez ofreció resultados novedosos en el tema, al reportarse por primera vez los niveles de expresión de ciertos genes en embriones bovinos elongados. Como elemento final, se transfirieron embriones clonados a hembras receptoras, lográndose gestación en la mitad de las hembras transferidas, lo que redundó en el nacimiento de dos terneras clonadas. La eficiencia del proceso fue similar a la descrita para la técnica de HMC y para la especie bovina. A pesar de las pérdidas gestacionales observadas, que también coinciden con lo reportado para la especie, se logró por primera vez en Chile el nacimiento de terneros clonados viables.
Generación de embriones bovinos por transferencia nuclear somática: evaluación de la capacidad de desarrollo in vivo e in vitro y de la expresión génica en las etapas pre y peri-implantatorias.
(Universidad de Concepción., 2009) Rodríguez Álvarez, Lleretny; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
La clonación somática es una poderosa herramienta para la producción de animales con un genotipo específico, ya sea para fines productivos a través de la multiplicación de ejemplares de alto valor genético, la creación de animales transgénicos o para la conservación de especies en peligro de extinción. En la última década esta tecnología se ha ido perfeccionando y hoy en día se ha logrado la obtención de clones en dieciséis especies de mamíferos. La aplicación de la transferencia nuclear es limitada debido a la ineficiencia del proceso en término de animales nacidos y al desconocimiento de la expresión génica que gobierna el proceso de clonación, por lo que es sujeto de estudio a nivel mundial. En este trabajo se empleó una metodología novedosa de transferencia nuclear somática, conocida como Hand Made Cloning (HMC) para generar embriones bovinos clonados, usando dos líneas celulares distintas como donantes de núcleo, una de fibroblastos de piel de un animal adulto y la otra de un feto. Se evaluó el potencial de desarrollo de los embriones generados con ambas líneas, en términos de desarrollo in vitro hasta blastocistos, así como morfología y calidad. Se demostró que con la línea celular adulta es posible generar con mayor eficiencia y calidad embriones clonados en bovinos.
Identificación y caracterización de células madre mesenquimales en endometrio bovino durante el ciclo estral y postparto sano y con endometritis.
(Universidad de Concepción., 2017) Lara Navarrete, Evelyn Elia; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
El objetivo de esta investigación fue identificar y caracterizar células madre mesenquimales en endometrio bovino a través del ciclo estral y en el postparto de vacas sanas y con endometritis. Por lo tanto, se plantea que el endometrio bovino presenta poblaciones de células madre mesenquimales y células progenitoras estromales que expresan marcadores de pluripotencia/multipotencia que varían en función del transcurso del ciclo estral y de la inflamación inherente a procesos patológicos puerperales. Este estudio permitió establecer un modelo animal para la obtención y caracterización de células madre mesenquimales en endometrio, lo que puede ser de gran utilidad en la obtención, identificación y caracterización de estas células en otras especies y/o potencial uso en medicina regenerativa.
Plasticidad de células felinas diferenciadas y su transición a mayores niveles de potencia.
(Universidad de Concepción., 2019) Echeverry Berrío, Diana Maritza; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
La obtención de células madre mesenquimales (MSC) en algunas ocasiones puede ser un procedimiento invasivo en los felinos, particularmente cuando existen patologías, traumas o situaciones específicas en las cuales está contraindicado el procedimiento quirúrgico para obtener biopsias de tejido. La inducción de células somáticas diferenciadas hacia células madre mesenquimales es una herramienta recientemente descrita en humanos y ratones, la cual promete ser exitosa y evadir las complicaciones descritas. Esta metodología se basa principalmente en modificar la expresión génica de las células diferenciadas con el uso de remodeladores epigenéticos, factores de crecimiento y pequeñas moléculas que facilitan la reconversión o de-diferenciación para la obtención de un mayor nivel de potencia. El objetivo del presente estudio fue evaluar la plasticidad de dos tipos celulares de origen felino, fibroblastos y células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (AMSC), frente a varios protocolos de inducción a multipotencia. Para lograr este objetivo se emplearon dos remodeladores epigenéticos, el ácido valproico y la 5-azacitidina, junto con plasma rico en plaquetas como fuente de factores de crecimiento, factor de crecimiento epidermal y factor de crecimiento derivado de plaquetas para conferir características multipotentes a las células reprogramadas. En este estudio también se produjo el factor de crecimiento derivado de plaquetas (h-PDGF-B) por transfección estable de células mamíferas. Los fibroblastos y AMSC fueron obtenidos de gatas domésticas entre 6 meses y 3 años. Los protocolos fueron estandarizados y se evaluó su efectividad en inducir características multipotentes reflejadas en expresión de genes de pluripotencia, marcadores de superficie y capacidad de diferenciación mesodérmica. La expresión de OCT4 incrementó significativamente en fibroblastos felinos (p < 0,05), así mismo se logró la diferenciación hacia linajes mesodérmicos (adipogénesis, condrogénesis y osteogénesis) con el uso del protocolo de reprogramación con 5AZA y VPA durante 12 días. Otros tratamientos arrojaron resultados parciales, confiriendo aumento en la expresión de OCT4 y/o capacidad limitada de diferenciación hacia uno o dos linajes mesodérmicos. Las AMSCs por su parte no presentaron cambios significativos en la expresión de genes o potencial de diferenciación con el uso de los remodeladores epigenéticos, con excepción de potenciar la diferenciación osteogénica con el pretratamiento con estas moléculas. Los resultados obtenidos demuestran que las células somáticas felinas presentan determinada plasticidad que puede ser aprovechada para diferentes eventos de reprogramación celular, en este caso, para obtener un estado multipotente o favorecer la diferenciación hacia determinado linaje mesodérmico. Sin embargo, este protocolo requiere algunos ajustes en orden de lograr una mayor eficiencia de reprogramación de fibroblastos hacia iMSCs. Estos resultados son de importancia para en el área de la medicina regenerativa y otras aplicaciones biotecnológicas en especies de la familia Felidae.
Pre-condicionamiento in vitro de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo equino, como herramienta para potenciar la adquisición de una mayor capacidad inmunomoduladora.
(Universidad de Concepción., 2018) Cabezas Salazar, Joel Gustavo; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
El objetivo de este trabajo fue aislar MSC desde tejido adiposo y evaluar atributos biológicos e inmunobiológicos a travez del precondicionamiento con PGE2, Sustancia P e IFNγ (molécula precondicionante canónica). Aquí aislamos y caracterizamos con éxito las MSC derivadas de tejido adiposo. Dichas células mostraron morfología similar a los fibroblastos, crecieron en plástico, duplicaron los tiempos de población de 46.4 ± 3.38 h, se diferenciaron en tres linajes (osteo, condro y adipogénicos) después de inducciones apropiadas, migraron hacia la atracción de Suero Fetal Bovino y exhibieron un patrón de marcadores de superficie comúnmente aceptados para caballos MSC. Todas estas son propiedades de MSC. Las células fueron precondicionadas con PGE2, SP e IFNγ y se evaluó la capacidad de las MSC de regular poblaciones de PBMC y la secreción de proteínas bajo estos estímulos. El precondicionamiento resultó en una mantención de las propiedades biológicas de las MSC virgen al precondicionarlas con PGE2 y SP, pero no así con IFNγ y un aumento en las propiedades inmunobiológicas de las MSC bajo los estímulos con PGE2 y SP, tratamiento que resultó ser el que mayor efectos inmunomoduladores generó sobre las MSC, como una mayor capacidad de inhibir poblaciones de PBMC activadas, producción de linfocitos T reguladores (CD4, CD25 y FOXP3)+ y un patrón de secreción de proteínas totamente diferente al estado virgen de éstas células, resultando en el primer análisis conocido de este tipo en MSC de equinos. En conclusión, las MSC derivadas de tejido adiposo equino, pueden ser precondicionadas in vitro, con el tratamiento de PGE2 y SP, para adquirir características que le otorgen un licenciamiento inmunológico más potente sin perder sus características biológicas de MSC. Posiblemente IFNγ, la molécula canónica para otorgar este licenciamiento en MSC, no resulta ser para las MSC equinas.
Valoración de las propiedades biológicas de las MSCs equinas aisladas de diferentes tejidos y su potencial uso terapéutico en endometritis en yeguas.
(Universidad de Concepción., 2020) Navarrete Aguirre, Felipe Ignacio; Castro Reboredo, Fidel Ovidio
El uso de terapias en base a células madre mesenquiales (MSC), está ampliamente descrito en equino, sin embargo, la mayoría de estas terapias se basan en el tratamiento de lesiones musculo esqueléticas, y en menor medida como uso potencial en afecciones reproductivas. En este estudio se evaluó el efecto de dos fuentes diferentes MSC obtenidas a partir del mismo donante sobre sus principales características biológicas in vitro y sus propiedades anti inflamatorias y anidamiento in vivo en yeguas con endometritis inducida post monta (PMIE). Se aislaron MSC equinas desde endometrio y tejido adiposo (ET-MSC y AT-MSC respectivamente) a partir de los mismos donantes. Las células mostraron rasgos característicos de MSC incluyendo la adherencia al plástico, marcadores de superficie, potencial de migración, así como la diferenciación mesodérmica clásica, además de lograr diferenciaciones neurogénica y cardiomiogénica. Se evaluó la influencia del origen celular en su perfil trascriptómico. Para esto se aisló y secuenció el ARN celular y se obtuvieron vesículas extracelulares (VE) a partir de un medio de cultivo celular libre de VE, y se analizó su carga de microARN (miARN) mediante secuenciación. Se analizó y comparó la expresión diferencial de ARNm y miARN-EV, así como las vías y procesos más representados en cada origen celular. Se identificaron un total de 125 genes regulados positivamente, 51 regulados negativamente y 31 miARN expresados diferencialmente entre células de ambas fuentes. Sobre la base de la secuenciación del ARNm, las ET-MSC mostraron una mayor expresión de genes involucrados en las vías de señalización Hippo, TGF-β y pluripotencia. Junto con esto, las vías involucradas en la reorganización de la matriz extracelular fueron las más representadas en la carga de miARN de las VE secretadas por ET-MSC. El nicho desde el que se originó la MSC definió el perfil transcriptómico de las células, incluida la secreción de VE específica de linaje para garantizar una comunicación y homeostasis adecuada. Posteriormente se evaluó y comparó el potencial uso de MSC de ambas fuentes como herramientas antiinflamatorias para PMIE, para esto se infundieron intrauterinamente (IU) MSC marcadas en yeguas con PMIE para evaluar su acción antiinflamatoria y anidamiento. Se indujo PMIE en nueve yeguas ginecológicamente sanas mediante la infusión IU de 500 millones de espermatozoides muertos en solución salina. Se analizaron marcadores de inflamación en lavados uterinos y biopsias antes (fase I) y 3 h después de la infusión de espermatozoides (fase II). Las mediciones llevadas a cabo fueron: conteo de células polimorfonucleres (PMN), proteínas IL-6 y TNF-α (ELISA en los lavados) e inmunotinción en biopsias, transcritos de IL-1α, 6, 8, 10, TNF-α y COX 2 (RT-qPCR de lavados). A las 24 h después de la deposición de espermatozoides (fase III), se infundio a las yeguas 20 ml IU de solución salina que contenía 2× 107 AT-MSC (n = 3, grupo 1) o ET-MSC (n = 3, grupo 2). Las células se marcaron previamente con el éster succinimidíl diacetato de carboxifluoresceína (CFDA SE). Un tercer grupo (n = 3) recibió solo 20 ml de solución salina estéril. Después de 48 h se realizó otra biopsia / lavado y se analizaron los mismos parámetros descritos anteriormente. Para evaluar el anidamiento, se tomaron biopsias adicionales en los días 10 y 30 post inoculación de MSC y se analizaron mediante microscopía confocal. Los espermatozoides muertos en solución salina aumentaron notablemente los recuentos de PMN, la expresión de IL-6 y TNF-α en el ELISA (p <0,05) y la inmunotinción. En la fase III se encontró una reducción significativa (p <0,0001) de PMN en todas las muestras, incluidas las yeguas control. Mediante ELISA se detectó una disminución (p <0,05) de IL-6 y TNF-α, en los grupos que recibieron MSC, pero no en el grupo control. En el grupo tratado con AT-MSC, se encontró una disminución significativa en la expresión de (IL-1α, p = 0,0003; IL-6 p 0.04; IL-8, p = 0.006, TNF-α p = 0.004). La expresión de IL-10 y COX-2 se mantuvo sin cambios (p = 0,08). En las yeguas que recibieron ET-MSC, IL-6, IL-8 y TNF-α disminuyeron significativamente (p = 0.01), IL-10 aumentó (p = 0.009), mientras que COX-2 e IL-1α no cambiaron significativamente su expresión. Mientras que el análisis de anidamiento, el marcaje con CFDA se encontró con moderación en todas las muestras analizadas hasta el día 30, principalmente en el compartimento estromal del endometrio. No se encontraron diferencias en el patrón de anidamiento entre los orígenes celulares. La inoculación de MSC redujo significativamente la inflamación independientemente del origen de las células y que las células realizan un recorrido limitado detectable después de un mes de infusión. Estos hallazgos pueden ser de ayuda para el diseño de nuevas terapias antiinflamatorias de enfermedades uterinas en yeguas.

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