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Co-expresión de una variante de la cápside del circovirus porcino tipo 2 e Interferón alfa porcino en un nuevo diseño de vectores de integración en Pichia pastoris.
(Universidad de Concepción., 2016) Gutiérrez Rojas, Fernando Alexis; Toledo Alonso, Jorge Roberto
El Síndrome de Desmedro Multisistémico Post-destete (PMWS), es una enfermedad viral producida por la infección del Circovirus porcino tipo 2 (PCV2). Este virus infecta células del sistema inmune como células dendríticas, monocitos y macrófagos, debilitando al animal contra infecciones de patógenos concomitantes. Los animales que cursan PMWS pueden alcanzar una morbi-mortalidad del 60%. Actualmente existen alternativas de vacunación que no eliminan la infección subclínica. En el presente trabajo, se muestra la generación de una formulación vacunal para la prevención del PMWS, la cual combina: Una variante antigénica de la cápside del PCV2 llamada Quimera1 con la citoquina inmunoreguladora INF-α porcino. Se diseñó un vector plasmidial que permite la integración genética estable en la levadura metilotrófica Pichia pastoris y la co-expresión de las dos proteínas de interés bajo el control del promotor inducible por metanol AOX1 propio de la levadura. El constructo génico favorece la expresión intracelular de la proteína Quimera1, mientras que la expresión de la citoquina fue direccionada a la ruta de secreción extracelular, para la facilidad de separación de las proteínas y la posible aplicación de estas fases en una formulación vacunal eficiente para controlar el PMWS. En este trabajo se demuestró por ensayos de dot blot y southern blot la correcta inserción del material genético en el ADN de las levadura generando clones de Pichia pastoris genéticamente transformados. Se demuestra la expresión de las proteínas recombinantes con los direccionamientos celulares seleccionados, mediante ensayos de western blot. La variante antigénica recombinante del PCV2 fue reconocida por el suero de animales naturalmente infectados con el PCV2, y el INF-α porcino secretado en el sobrenadante de cultivo promueve efectivamente la proliferación de mononucleares de sangre periférica
Desarrollo de vacunas de ADN basado en la expresión de las proteínas BruAb01_257 y BruAb01_273 de la isla de genómica III de Brucella abortus.
(Universidad de Concepción., 2011) Sislema Egas, Fernanda del Rocío; Oñate Contreras, Ángel
La Brucelosis es una enfermedad zoonótica de distribución mundial que afecta a humanos y animales, produciendo millones de pérdidas. Una vacuna eficaz y segura sería útil para el control de la enfermedad. Hay vacunas contra la brucelosis, desarrolladas a partir de cepas atenuadas, pero se ha demostrado que estas no son aplicables a seres humanos e incluso existe la posibilidad que la cepa atenueada revierta a su forma virulenta. Por otro lado, la inmunización con ADN plasmidial que transporta determinada proteína antigénica, podría ser un método alternativo para la vacunación contra enfermedades infecciosas como la brucelosis, principalmente por mostrar que éstas, tras su inmunización, promueven una respuesta celular y humoral in vivo contra el microorganismo, en base al antígeno protéico. El conocer qué proteínas o componentes de éstas, activan la respuesta inmune protectora, es la clave para su éxito. Por lo tanto este estudio tuvo como objetivo determinar la respuesta inmune inducida en modelo murino, mediante la inmunización de plásmidos que transportan y que expresan los marcos de lectura BruAb1_0257 y BruAb1_0273 que conforman la isla genómica III de B. abortus. Para esto se construyó éstas vacunas, mediante la inserción de los segmentos génicos mencionados en el vector pVAX-Flag, obteniendo los vectores recombinantes pVAX- Flag257 y pVAX-Flag273. La administración intramuscular de éstas vacunas en ratones BALB/c produce respuesta inmune humoral y celular. Los animales inoculados con estas vacunas desarrollaron anticuerpos especifícos contra las proteínas BruAb1_0257 y BruAb1_0273, exhibiendo una dominancia de la inmunoglobulina IgG2a. Adicionalmente, las vacunas muestran una fuerte proliferación linfocitaria con la producción de INF- pero no de IL-4 e IL-10 y, observamos una disminución en la colonización en el bazo por parte del patógeno posterior al desafío con B. abortus cepa 2308, en todos los animales inmunizados con los plásmidos recombinantes. Estos resultados sugieren que la utilización de genes codificados en la isla genómica III de B. abortus, para la formulación de vacunas de ADN, pueden tener potencial como una vacuna de ADN para inducir inmunidad en modelo murino.
Estudio de los componentes estructurales que median el proceso de reconocimiento del ADN dañado.
(Universidad de Concepción., 2011) Cifuentes Huerta, Juan José; Melo, Francisco; Martínez, José
El daño en el ADN y su reparación juegan roles críticos en enfermedades como el cáncer y el envejecimiento. Sin embargo, cómo las proteínas de detección de daño reconocen diferentes aductos en el genoma y cómo diferentes proteínas de detección pueden reconocer la misma lesión es una pregunta abierta hasta la fecha. Aquí, mediante un análisis estadístico amplio y comparativo sobre estructuras tridimensionales de complejos proteína-ADN dañado y estructuras de ADN aislado demostramos que las lesiones inducen un cambio local en la estructura del ADN ensanchando el surco menor. Ésta característica común es utilizada por las proteínas de detección de daño, las que en este punto intercalan un residuo de fenilalanina u otro residuo con capacidad de apilarse con las bases nitrogenadas ensanchando aún más el surco menor del ADN. Además, mostramos que los residuos de inserción pertenecen a motivos conservados de estructura secundaria. Estas características están presentes en vías de reparación como Nucleotide Excision Repair, Base Excision Repair y Mismatch Repair y en otras proteínas de reparación que no pertenecen a ninguna vía. Finalmente, estas caracteristicas se encontraron en proteínas como la TATA Binding Protein y la High Mobility Group B, indicando un mecanismo común de lectura indirecta de reconocimiento de ADN, que involucra residuos con capacidad de apilamiento y que se basa en un surco menor ensanchado del ADN blanco.
Evaluación funcional de regiones no-codificantes conservadas predichas como enhancers en el intrón 5 del gen RUNX1.
(Universidad de Concepción., 2010) Rebolledo Jaramillo, Boris Eduardo; Gutiérrez Gallegos, Soraya Elisa
El gen RUNX1 codifica para un factor de transcripción que regula el desarrollo del sistema hematopoyético. Fue inicialmente descrito por su participación en t(8;21), una de las translocaciones cromosomales más frecuentes en leucemia mieloide aguda. Los quiebres cromosomales que generan t(8;21) se agrupan en el intrón 5 del gen RUNX1, el cual presenta características estructurales de la cromatina comúnmente asociadas a la presencia de elementos reguladores activos de la transcripción: un sitio hipersensible a DNasa I, sitios de corte para Topoisomerasa II e histonas acetiladas, incluyendo la marca epigenética H3K9/14Ac, la cual se ha asociado a enhancers funcionales. Muchos genes, principalmente aquellos involucrados en el desarrollo, requieren elementos genómicos distantes en cis (enhancers, silencers, insulators) que permitan controlar espacio-temporalmente su transcripción. Actualmente, la aproximación más eficaz y más usada para predecir este tipo de elementos reguladores es un análisis de genómica comparada. Tomando en cuenta las características estructurales de la cromatina que presenta el intrón 5 del gen RUNX1, en nuestro laboratorio se buscaron secuencias no-codificantes conservadas (CNS) dentro del intrón, para predecir la posición de potenciales elementos reguladores. A partir del alineamiento del gen RUNX1 humano, con sus ortólogos de ratón y rata, se identificaron nueve regiones conservadas, de las cuales sobresalieron la región CNS-K, debido a su asociación con la marca epigenética H3K9/14Ac relacionada a enhancers funcionales y la región CNS-L, debido a su alta conservación evolutiva a nivel de vertebrados. En este trabajo se evaluó la funcionalidad de las regiones CNS-K y CNS-L como elementos reguladores de la transcripción tanto en células en cultivo, como in vivo, mediante transgénesis en X. tropicalis. Los resultados en células en cultivo mostraron que las regiones tienen actividad regulatoria independiente de posición y distancia respecto al promotor asociado, cumpliendo con los dos requerimientos que definen a los enhancers y silencers. Además se observó que estas regiones tienen un comportamiento dependiente del contexto celular y región promotora. La evaluación funcional in vivo mostró que las regiones son funcionales en el contexto de un organismo completo, confirmando su rol como elementos reguladores. En conclusión, se definieron dos elementos reguladores de la transcripción funcionales en el intrón 5 del gen RUNX1, lo cual coincide con la evidencia experimental que muestra que la estructura de la cromatina de este intrón se encuentra en una conformación que favorece la interacción entre factores de transcripción y el ADN.
Función de hC/EBPβ en la regulación transcripcional del gen de albúmina humano.
(Universidad de Concepción., 2014) Valenzuela Riffo, Nicole Andrea; Gutiérrez Contreras, José Leonardo
La transcripción génica es un proceso en el que se ven involucradas una gran cantidad de complejos moleculares que tienen como objetivo generar una copia exacta de ARN a partir de una secuencia de ADN codificante. Uno de los elementos fundamentales que participan de este suceso son los factores de transcripción, agentes de origen proteico cuya denominación deriva de su acción moduladora de este proceso y que son capaces de reclutar y/o asociarse con cofactores, otros factores de transcripción, complejo RNA polimerasa y complejos modificadores de cromatina. Esta última asociación cobra gran importancia en la etapa previa al inicio de la transcripción, donde es necesario modificar la cromatina desde un estado inactivo o compacto a un estado activo o relajado. Esto con la finalidad de que la maquinaria transcripcional tenga acceso a la región regulatoria del gen; hoy se sabe que los factores de transcripción tienen la capacidad de reclutar a estos modificadores de cromatina, actuando como un componente esencial en la regulación transcripcional. Un factor de transcripción que posee esta capacidad es CCAAT/enhancer-binding protein beta (C/EBPβ), el cual se encuentra involucrado en un gran número de procesos biológicos. Existe en humano como 3 isoformas provenientes de un gen sin intrones y un mismo ARNm (hC/EBPβ1, hC/EBPβ2 y hC/EBPβ3). Se ha descrito que este factor puede actuar como activador o inhibidor transcripcional, dependiendo de la isoforma participante y de la presencia de modificaciones post-traduccionales en ellas. Un estudio de nuestro laboratorio reveló la existencia de una interacción física entre las isoformas de hC/EBPβ y complejos ACF/CHRAC, pertenecientes a la subfamilia de complejos remodeladores de cromatina ATP-dependientes ISWI, además de sugerir una conexión funcional entre ambos factores apuntando a una regulación de la actividad transcripcional sobre genes regulados por el factor de transcripción. Con estos antecedentes y con el objetivo de establecer un rol funcional a esta interacción, se determinó estudiar el gen de albúmina humano, ya que estudios independientes han mostrado regulación por C/EBPβ y además presencia física de SNF2H, subunidad ATPasa de los complejos de la subfamilia ISWI, en su promotor. Con esto nos planteamos como hipótesis que las isoformas de hC/EBPβ y el complejo remodelador de la subfamilia ISWI juegan un rol regulatorio conjunto en la transcripción del gen de albúmina humano, y para comenzar a dilucidar los mecanismos por los cuales ocurriría esto planteamos como objetivo de esta tesis el determinar la función regulatoria de SNF2H y de las isoformas de C/EBPβ en la expresión del gen de albúmina humano. Ensayos de qRT-PCR en células HepG2 transfectadas de forma temporal con vectores que codifican para las isoformas de hC/EBPβ y para hSNF2H, mostraron que hC/EBPβ1 y hC/EBPβ2 presentaron un efecto activador, mientras que hC/EBPβ3 y SNF2H un efecto represor sobre la expresión de albúmina. Con el objeto de analizar la participación de estas proteínas en la regulación de la expresión del gen de albúmina en un contexto celular se buscó una condición de cultivo que tuviera un impacto significativo sobre la expresión de albúmina. Para esto se utilizó DMSO, insulina y el factor de crecimiento TGFβ1, siendo este último el que tuvo un mayor impacto sobre la expresión de este gen, con un efecto represor. Al analizar la presencia de las proteínas en el núcleo se observó reducción de SNF2H en el tratamiento con TGFβ1 y concomitantemente reducción de la presencia física de esta proteína en el promotor del gen de albúmina, al igual que de C/EBPβ. Para profundizar en el efecto generado por los factores sobre el gen de albúmina se probó el efecto de reducir los niveles de SNF2H y C/EBPβ sobre la expresión de este gen, mediante el uso de siRNA. Se probaron diferentes concentraciones de siRNA y del reactivo de transfección, no observándose diferencia en la expresión de las proteínas en el núcleo, por lo que no fue posible realizar análisis posteriores en base a estos tratamientos. Finalmente, nuestros estudios sugieren que existe una relación funcional de C/EBPβ y SNF2H en la regulación del gen de albúmina, aunque se requieren más estudios para confirmar la existencia de una relación entre el factor de transcripción y el complejo remodelador en la regulación de este gen.
Influencia de factores de transcripción sobre la actividad “In Vitro“ de los complejos SWI/SNF de mamíferos.
(Universidad de Concepción., 2011) Fernández García, Yaiza; Gutiérrez Contreras, José Leonardo
Los organismos eucariotas presentan su material genético nuclear organizado en asociaciones proteína-ADN formando estructuras conocidas como nucleosomas, los cuales se encuentran repetidos y agrupados dando origen a la cromatina. Más allá de su papel estructural, la cromatina participa en la regulación de procesos fundamentales a nivel del ADN. El acceso a las regiones promotoras de los genes por parte de la maquinaria transcripcional de la célula es una de las principales barreras en la expresión génica y se ve restringido dado el denso arreglo de la cromatina. El ensamblaje de la ARN polimerasa II a los promotores es orquestado por diversos factores de transcripción. Estos se caracterizan por presentar dominios de unión al ADN que les permiten la identificación de secuencias específicas. Poseen además regiones que les permiten la interacción con otras proteínas o complejos proteicos, lo que implica que pueden reclutar diversas entidades a sitios concretos del genoma. Entre los complejos proteicos que pueden ser reclutados se encuentran aquellos con la habilidad de remodelar la cromatina, destacándose los de la familia SWI/SNF. Esta familia de complejos emplea la energía obtenida a partir de la hidrólisis de ATP para movilizar nucleosomas de dos formas; en cis, “sliding” o en trans, “eviction”. Con el objetivo de evaluar la influencia de factores de transcripción sobre la actividad remodeladora “in vitro” de complejos SWI/SNF en mamíferos, se realizaron ensayos de remodelación nucleosomal para hSWI/SNF en presencia del factor hERα. Se observó que este receptor nuclear tiene la capacidad de reclutar a hSWI/SNF hacia secuencias diana y concentrar su actividad de sliding en una zona precisa. Nuestros resultados muestran que hERα no gatilla la actividad de desplazamiento del nucleosoma en trans de los subtipos de complejos hSWI/SNF estudiados.
Rol transcripcional de secuencias repetidas insertas en un enhancer osteoblástico del gen col 1A1 de xenopus tropicalis
(Universidad de Concepción., 2017) Contreras Oviedo, Pedro Felipe; Marcellini Liotaud, Sylvain
Los enhancers son elementos regulatorios que actúan sobre un promotor basal diana para controlar la transcripción génica. Por otra parte, las secuencias repetidas resultan de múltiples re-arreglos genómicos acumulados a través del tiempo evolutivo. Existe evidencia de su potencial rol en la regulación transcripcional cuando se encuentran presentes en enhancers o promotores. No obstante, dichos estudios se encuentran restringidos en su mayoría a modelos mamíferos y a unos pocos tejidos, principalmente neurales y placenta. Hasta la fecha dicho fenómeno no ha sido estudiado ni en anfibios ni en tejido óseo. En el presente trabajo, nos enfocamos en un enhancer óseo del gen Col1a1 de la rana africana X. tropicalis el cual se encuentra invadido por una región repetida cuyas copias se encuentran presentes en cientos de otras regiones genómicas. Estudios previos de nuestro laboratorio revelaron que este elemento regulatorio, denominado Enhancer-1073, es capaz de activar la expresión del reportero GFPn en osteoblastos primarios de X. tropicalis, y que además, esta actividad transcripcional es dependiente de la presencia de secuencias repetidas que lo invaden. Hemos desarrollado un protocolo experimental novedoso y más eficiente, el cual combina la electroporación de osteoblastos primarios de X. tropicalis con un posterior análisis de intensidad de fluorescencia mediante citometría de flujo. Estas mejoras experimentales no solo permitieron validar los resultados obtenidos en los estudios previos, sino también, permitieron demostrar que la región repetida del Enhancer-1073 es suficiente para recapitular la actividad transcripcional del enhancer completo. Este es un estudio único en su clase, el cual además de expandir el espectro de enhancers invadidos por secuencias repetidas a un nuevo tejido (hueso) y modelo experimental (Xenopus), es el primero en demostrar el rol funcional de las secuencias repetidas en enhancers activos de hueso. Adicionalmente, entregamos un aporte conceptual al campo de la diversificación de los distintos tipos celulares esqueléticos. Proponemos un modelo para explicar cómo la movilización de secuencias repetidas incluidas en enhancers permitió co-optar el programa genético involucrado en formación de matriz cartilaginosa mineralizada presente en un vertebrados ancestral, para facilitar la emergencia evolutiva de los osteoblastos y, por ende, del tejido óseo per se.

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