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Efectos de α-sinucleína en neuronas del sistema nervioso central.
(Universidad de Concepción., 2013) Pacheco Murillo, Carla Rocío; Aguayo Hernández, Luis Gerardo; Opazo M., Carlos
La enfermedad de Parkinson es un desorden neurodegenerativo progresivo que se caracteriza por la presencia de agregados proteicos denominados cuerpos de Lewy, que están constituidos principalmente por la proteína -sinucleína, cuyo rol en esta enfermedad aún no se ha determinado. Sin embargo, estudios genéticos en humanos y biología molecular en ratones, sugieren que -sinucleína estaría involucrada en la aparición temprana de la enfermedad de Parkinson. Al respecto, se ha postulado que la acumulación de -sinucleína en el espacio extracelular podría alterar membranas neuronales a través de la formación de “estructuras tipo poro”, lo que llevaría a alteraciones en la homeostasis iónica de la célula. No obstante, esto nunca ha sido demostrado en membranas neuronales. En la presente tesis se realizaron una serie de experimentos electrofisiológicos, bioquímicos y de biología celular que indican que oligómeros de -sinucleína (500 nM) rápidamente se asocian de manera puntiforme a neuronas hipocampales, dado principalmente por el componente proteico de la membrana, lo que resulta en un incremento en la conductancia (5 veces sobre el control) con el subsecuente influjo de Ca2+ y de un análogo fluorescente de glucosa. Este incremento en el Ca2+ intracelular (1.7 veces sobre el control) causa un incremento significativo en diferentes parámetros de la transmisión sináptica tales como la frecuencia de las transitorias de Ca2+, la frecuencia de las corrientes sinápticas en miniatura, el decaimiento de la fluorescencia asociada a FM1-43 y el aumento en el número de puntas para SNAP25, lo que ocurre sin cambios en la viabilidad neuronal. Sin embargo, se observaron algunos cambios morfológicos apoptóticos asociados a neuronas hipocampales circundadas por “macro” agregados de -sinucleína. Al realizar incubaciones prolongadas con oligómeros de -sinucleína (5 M por 24 horas), todavía en ausencia de cambios en la viabilidad celular, se observó una depleción vesicular representada por la disminución en el número de puntas para SV2, sugiriendo que oligómeros de -sinucleína inducirían un falla sináptica en forma concentración-tiempo dependiente. Esto concuerda con los resultados obtenidos con otras proteínas amiloides formadoras de poros, como el A, el cual en condiciones crónicas de tratamiento induce una disminución en la transmisión sináptica de neuronas hipocampales. Es importante destacar que el efecto perforante de oligómeros de -sinucleína es célula dependiente, ya que la línea celular dopaminérgica RCSN-3, fue resistente a la acción permeabilizante de -sinucleína, incluso en presencia de un conocido inductor de Parkinsonismo como lo es el pesticida rotenona, lo que se correlacionó con la formación de cuerpos de inclusión constituidos por la proteína exógena con características tipo agresoma. Nuestros resultados indican además que éstos agregados intracelulares indujeron la formación de agregados de -sinucleína endógena. Sin embargo, a pesar de la resistencia presentada en las células RCSN-3, -sinucleína indujo un incremento en los niveles de Ca2+ intracelular, efecto bloqueado en presencia de Co2+, bloqueador inespecífico de canales de Ca2+. En conclusión, las evidencias presentadas permiten proponer que las acciones extracelulares de oligómeros de -sinucleína podrían estar mediadas por la formación de perforados de -sinucleína en la membrana plasmática como también por la formación de cuerpos de inclusión de esta proteína, lo cual explicaría las etapas iniciales de la sinaptotoxicidad que proponemos conduce a la neurodegeneración que se observa en las etapas tardías de las enfermedades neurodegenerativas asociadas con la acumulación de -sinucleína extracelular. Esta información podría ser de utilidad para implementar nuevas estrategias terapéuticas para aliviar los problemas motores y cognitivos que presentan los pacientes con la enfermedad de Parkinson.
Efectos intracelulares del péptido beta-amiloide en la transmisión sináptica y la excitabilidad neuronal.
(Universidad de Concepción., 2019) Fernández Pérez, Eduardo Javier; Aguayo Hernández, Luis Gerardo
La enfermedad de Alzheimer (EA) es uno de los trastornos cerebrales más comunes que se caracteriza histopatológicamente por la presencia de estructuras macroscópicas extracelulares a nivel cerebral llamadas placas seniles, que consisten principalmente de agregados del péptido β-amiloide (Aß), el cual oligomeriza, formando diferentes estructuras: oligómeros, protofibras y fibrillas, siendo las primeras las especies más tóxicas reportadas en la literatura. Adicionalmente, se ha descrito la presencia intracelular del péptido en numerosos compartimentos intraneuronales (mitocondria, retículo endoplásmico (RE), endosomas y lisosomas). Por otra parte, se ha observado que modelos de ratones transgénicos desarrollan una acumulación intraneuronal de Aβ a los 3-4 meses de edad, un evento temprano en relación a la aparición de Aβ extracelular, y que es cuando los déficits cognitivos son detectados por primera vez. Sin embargo, los efectos intracelulares de Aβ han sido mínimamente estudiados, por lo surge la pregunta ¿podrían oligómeros de Aβ intracelular (iAβo) tener un efecto en la neurotransmisión? Utilizando la técnica de patch clamp para aplicar iAβo y al mismo tiempo registrar la excitabilidad neuronal y la actividad sináptica, encontramos que aumentaba la frecuencia (efecto pre-sináptico) y la amplitud (efecto post-sináptico) de las corrientes sinápticas, así como también la generación de potenciales de acción. Este efecto fue específico para especies oligoméricas. La alteración de los niveles globales de Ca2+ intracelular no tuvo un efecto sobre la acción post-sináptica de iAβo, pero el efecto pre-sináptico sí se vio disminuido al aumentar el Ca2+ citosólico, lo que sugiere una regulación compleja de los efectos de iAβo en la frecuencia de las corrientes sinápticas. iAβo afectó tanto la transmisión excitatoria mediada por el receptor post-sináptico de AMPA, como la inhibitoria mediada por GABAA, pero el efecto fue más potente en la primera, afectando de manera importante la amplitud de la corriente AMPAérgica, sugiriendo un mecanismo a nivel post-sináptico. Por otro lado, iAβo también afectó la frecuencia de ambos tipos de neurotransmisión, excitatoria e inhibitoria, sugiriendo un mecanismo pre-sináptico que afectaba a ambas. La co-aplicación de un inhibidor de PKC (Queleritrina) disminuyó tanto la frecuencia como la amplitud de las mPSCs a niveles control, indicando que los mecanismos pre- y post-sináptico involucraban la participación de esta quinasa. El aumento en la frecuencia de las corrientes sinápticas se observó al mismo tiempo que produjo un incremento significativo en la generación de óxido nítrico (NO) tanto en la neurona que contenía iAβo como en las neuronas aledañas a ésta. La preincubación con el inhibidor de NO sintasa L-NAME disminuyó significativamente el efecto de iAβo sobre la frecuencia de las corrientes sinápticas, así como también en la generación de NO, sugiriendo que el mecanismo pre-sináptico de iAβo estaba mediado por NO. En conjunto, estos datos sugieren iAβo aumentó la excitabilidad neuronal sin alterar las propiedades del potencial de acción o las propiedades intrínsecas de la membrana celular, sino que más bien a través de una alteración en las propiedades de la transmisión sináptica de la neurona mediante un mecanismo pre-sináptico dependiente de NO y un mecanismo post-sináptico mediado por el receptor de AMPA, involucrando en ambos la participación de PKC.
Evaluación de las propiedades funcionales y bioquímicas de los residuos KK385-386 del receptor de glicina α 1 en la modulación por etanol en el sistema nervioso central de ratones transgénicos.
(Universidad de Concepción., 2016) Muñoz Ramírez, Braulio Alfredo; Aguayo Hernández, Luis Gerardo
Estudios previos en nuestro laboratorio han demostrado que la corriente de cloruro (Cl-) activada por glicina puede ser potenciada por concentraciones bajas y clínicamente relevantes de etanol. Además, se ha demostrado la modulación intracelular mediada por el dímero GβУ de la proteína G sobre el Receptor de Glicina (R-Gli) α1, mediante la interacción con los aminoácidos básicos (316-320 y 385/386) localizados en el loop intracelular TM3-TM4. R-Gli α1 mutado en los residuos 316-320 y 385-386, son resistentes a la modulación del dímero GβУ y también insensibles a los efectos de etanol. Además, datos recientes han demostrado que R-Gli sería importante en el sistema de recompensa del cerebro (Área Tegmental Ventral; VTA, Corteza prefrontal; PFC y núcleo accumbens; nAc). Es por ello, que se ha generado un ratón Knock-In (KI) para R-Gli α1, el cual posee mutaciones KK385-386AA, generándose un animal KI KK385/386AA. En esta tesis, evaluamos las propiedades de los receptores expresados in situ en neuronas de animales WT y KI de regiones involucradas con el sistema mesolímbico dopaminérgico (nAc, PFC y VTA). Primero, caracterizamos bioquímicamente (PCR, western blot e inmunocitoquímica) la presencia de mRNA y proteínas pre y post sinápticas importantes para el balance excitatorio-inhibitorio. Encontramos, que no existen grandes diferencias en la expresión de proteínas en regiones del sistema nervioso central (SNC) de WT y KI, sólo se muestra un incremento en las proteínas pre sinápticas GAD67 y vGLUT en el cerebelo del ratón KI, que están relacionadas con la síntesis de GABA y transporte de glutamato, respectivamente. Luego, a través de estudios electrofisiológicos en neuronas disociadas de nAc, evaluamos y comparamos funcionalmente la modulación por etanol entre neuronas de ratones WT y KI en nAc. Encontramos que las neuronas accumbales KI son menos sensibles a los efectos de etanol mediados por GβУ . Además, utilizando el animal D1-GFP, comparamos la sensibilidad a etanol entre Medium Spiny Neurons (MSNs) D1+ y D1-, encontrando que las MSNs D1+, son sensibles a bajas concentraciones de etanol (1, 5 y 10 mM), mientras que las D1-, son sensibles a altas concentraciones (50, 100 mM). Posteriormente, utilizando rebanadas de nAc, determinamos la presencia de R-Gli no-sinápticos y sinápticos que median corrientes tónicas y fásicas, respectivamente. Encontramos, que MSNs poseen corrientes tónicas y fásicas, siendo sólo las primeras sensibles a bajas concentraciones de etanol, mientras que las segundas son insensibles. Sugiriendo que R-Gli no-sinápticos sensibles a etanol, estarían participando en el balance excitatorio-inhibitorio del nAc, debido a que etanol disminuyen los potenciales de acción (AP) sólo en MSNs WT, siendo este efecto bloqueado por estricnina (STN). Finalmente, con estudios de comportamiento, encontramos que ratones KI fueron similares a WT en condiciones controles, pero cuando se desarrolló la prueba de Perdida del reflejo de enderezarse (LORR), ratones KI mostraron un menor tiempo de sedación a concentraciones altas de etanol (3.5 g/kg). Además, animales KI mostraron mayor consumo y preferencia a etanol. En conclusión, esta tesis nos ayuda a entender el rol de R-Gli α1 en el sistema de recompensa, con el fin de analizar la acción fisiológica de etanol en el desarrollo patológico del abuso alcohólico y alcoholismo.
Identificación de residuos localizados en el dominio citoplasmático entre las regiones TM3 y TM4 críticos para la modulación alostérica de receptores de glicina y GABAa por propofol y etanol.
(Universidad de Concepción., 2009) Moraga Cid, Gustavo Alonso; Aguayo Hernández, Luis Gerardo
A pesar de los extensos estudios realizados a lo largo de casi un siglo, los mecanismos involucrados en los efectos ejercidos por etanol y anestésicos generales sobre la función del SNC permanecen poco entendidos. En contraste a lo que ocurre con otras clases de drogas, los efectos de etanol y anestésicos generales fuéron por largo tiempo atribuidos a la acción en múltiples sitios inespecíficos localizados a nivel de la membrana plasmática. Sin embargo, a partir de la década de 1980 comenzó a cobrar vigor la hipótesis que propone a proteínas como blancos específicos de estos fármacos. En este contexto, los receptores para los neurotransmisores glicina (RGli) y acido γ-aminobutirico (RGABAA) han surgido como los blancos moleculares más importantes para los efectos ejercidos por etanol y anestésicos generales. La hipótesis actualmente aceptada para explicar los mecanismos moleculares por los cuales ocurren estos fenómenos de modulación, propone la existencia de potenciales sitios de interacción usados tanto por etanol como por anestésicos generales. Los residuos que componen estos potenciales sitios se encuentran localizados en las regiones transmembrana (TMs) del receptor, ubicación que les permite formar bolsillos o cavidades capaces de reconocer, con muy baja selectividad, una serie de moduladores estructuralmente divergentes. Por otra parte, evidencia reciente ha permitido generar una hipótesis alternativa. Ésta propone que la modulación del RGli está intrínsicamente ligada al grado de activación de las proteínas G. Estudios realizados en nuestro laboratorio permitieron sugerir que ésta modulación es producto de la interacción del heterodímero Gβγ con un grupo de residuos (316RFRRK320 y 385KK386) localizados en el dominio citoplasmático entre el TM3 y TM4 del RGli. Basados en estas observaciones, surgen una serie de interrogantes que necesitan ser respondidas, como por ejemplo, ¿Son estos sitios compartidos por otros moduladores alostéricos del RGli? o ¿Posee también este dominio intracelular residuos aminoacídicos determinantes para la sensibilidad del RGli a otros moduladores? ¿Existen residuos homólogos en la región citoplasmática de otros miembros de la superfamilia LGICs que cumplan un rol similar?De esta forma, el trabajo realizado en ésta tesis generó información que permitió contestar algunas de estas importantes interrogantes. Primero, abordamos el grado de selectividad de estos nuevos sitios descritos como críticos para etanol en términos de la sensibilidad a otros moduladores del RGli. Nuestros datos muestran que la mutación de estos residuos redujo significativamente la sensibilidad del RGli a etanol, sin alterar la capacidad del receptor de ser modulado por otros fármacos alostéricos, como n-alcoholes o anestésicos generales. Además, estudiamos el fenómeno de “cutoff” en una serie homóloga de n-alcoholes, el cual indirectamente podría dar cuenta de la presencia de una cavidad o bolsillo con un volumen determinado. En particular y a diferencia de lo reportado para los sitios transmembrana, estos residuos (316RFRRK320 y 385KK386) no formarían un bolsillo de unión, con un volumen aceptor determinado, debido a que el fenómeno de cutoff no sufrió modificaciones en los RGli hiposensibles a etanol. Estos observaciones muestran por primera vez que residuos importantes para la acción de etanol en el RGli, no son relevantes para la sensibilidad del receptor a otros moduladores alostéricos, lo que nos permite sugerir que este nuevo mecanismo de acción descrito para etanol, es de una naturaleza molecular diferente a los mecanismos utilizados por otros moduladores del RGli. Con estos datos en mente, es claro que existen residuos localizados en el dominio intracelular importantes para los efectos de etanol sobre el RGli, pero ¿es esta región importante para la acción de otros moduladores como anestésicos generales? Nuestros datos funcionales nos permiten sugerir un nuevo sitio para la acción del anestésico general intravenoso propofol, distinto a los descritos previamente, y más aún nos permiten sugerir por primera vez que la potenciación de las corrientes de glicina y GABA por propofol ocurre principalmente por una vía intracelular. Estas conclusiones se encuentran sostenidas por los datos obtenidos a través de tres estrategias experimentales independientes. Primero, utilizando estudios de mutagénesis sitio dirigida, realizados en los dominios citoplasmáticos de las subunidades α1 del RGli y α1 y β2 del RGABAA, determinamos que un residuo de Fenilalanina, localizado en regiones homólogas de la subunidades α1 del RGli (F380) y α1 del RGABAA (F385) es el responsable de la sensibilidad a propofol, mientras que la subunidad β2 del RGABAA no juega un rol crítico en la sensibilidad de este receptor a propofol. Estos sitios demostraron ser altamente selectivos para propofol, no resultando relevantes para la potenciación del receptor por otros moduladores alostéricos. Segundo, utilizando diálisis intracelular de proteínas con demostrada capacidad de unir propofol, determinamos que propofol debe alcanzar el espacio intracelular como un paso previo a la modulación de los RGli y RGABAA, tanto en sistemás recombinantes de expresión como en neuronas en cultivo. Tercero, utilizando análisis de registros de canal único determinamos que la sustitución de los residuos F380 en el RGli y F385 en el RGABAA redujo significativamente la potenciación de la probabilidad de apertura del canal, sin alterar sus parámetros cinéticos como el tiempo de apertura promedio y su conductancia. En conclusión, los datos generados en esta tesis nos permiten extender nuestro conocimiento acerca de los mecanismos involucrados en la modulación alostérica de los miembros de la superfamilia LGICs. Nuestros resultados nos permiten sugerir que el dominio citoplasmático mayor de los miembros de la familia LGICs, presenta residuos específicos y distintos para la acción de etanol y propofol. Estos resultados permiten además, iniciar nuevos estudios en la generación de drogas con minimos efectos indeseados.
La potenciación del receptor de glicina por etanol en neuronas D1 MSN del núcleo Accumbens regula el consumo y preferencia por etanol.
(Universidad de Concepción., 2020) Gallegos Gallegos, Scarlet Soledad; Aguayo Hernández, Luis Gerardo
Las áreas cerebrales que forman el circuito neuronal de recompensa también participan en el control del consumo de etanol. El núcleo Accumbens (nAc) es una importante región de este circuito que expresa receptores de glicina (R-Gli), un canal iónico inhibitorio activado por ligando. Estudios recientes reportaron la presencia de distintas subunidades del R-Gli en el nAc, siendo la 1 la más prevalente. Se reportó también una mayor sensibilidad a glicina del R-Gli, así como una mayor densidad de corriente en neuronas de tipo D1 MSN del nAc al comparar con las neuronas de tipo D2 MSN. Sin embargo, existe un número de interrogantes que necesitan responderse sobre el rol en el control de la excitabilidad neuronal, la sensibilidad a etanol y la conformación del R-Gli en el nAc. Este trabajo de tesis, utilizando técnicas como inyección de adenovirus asociados y modelos de ratones modificados genéticamente, se aportó información por primera vez sobre el origen de la inervación glicinérgica en el nAc, la que provenía del mesencéfalo. Además, detectamos corrientes tónicas mediadas por el R-Gli en neuronas D1 MSN, las que fueron sensibles a bajas concentraciones de etanol (desde 10 mM). Encontramos que etanol causó una disminución significativa en el disparo de potenciales de acción solo en neuronas D1 MSN, implicando un efecto en la denominada vía directa, que favorece las conductas adictivas. Utilizamos, además un ratón modificado genéticamente, generado por nuestro grupo de colaboradores, denominado KI 2, el cual presenta una mutación en residuos que son importantes para la potenciación por etanol cuando se expresa el R-Gli con conformación 2. Los R-Gli en neuronas del nAc de este ratón se potenciaban significativamente menos por etanol que en el ratón WT. Estas neuronas presentaron corrientes tónicas insensibles a etanol, lo cual tampoco provocó cambios en la excitabilidad del nAc del ratón KI 2, lo que si ocurría en el ratón WT. Por lo tanto, apoyando la idea que la subunidad 2 del R-Gli tendría un rol en la regulación inhibitoria del nAc. Los resultados obtenidos en los estudios de comportamiento mostraron que el ratón KI 2 se comportaba de manera similar al ratón WT, lo que implicó que la mutación no afectaba la funcionalidad del receptor. La administración de dosis intoxicantes de etanol (> 2 g/kg) en el ratón KI 2 mostró que estos se recuperaban más rápido que los WT. Adicionalmente, los ratones KI 2 consumieron más etanol que los ratones WT en los primeros días de prueba (modelo de binge drinking), apoyando una función protectora del R-Gli contra la ingesta excesiva de alcohol. En conclusión, esta tesis permitió responder varias interrogantes sobre la función del R-Gli en el nAc, específicamente en neuronas D1 MSN y su sensibilidad a etanol. La subunidad 2 posee una función inhibitoria sobre la excitabilidad en el nAc en presencia de etanol, lo que se pierde en el modelo KI. La disminución de la sensibilidad del R-Gli mutado se traduce en una marcada reducción de la sedación y un aumento del consumo de etanol. Todos estos resultados proporcionan nuevos elementos que ayudan a entender las bases neurobiológicas de los efectos de etanol en el cerebro.
Presencia de aminoácidos básicos en el dominio citoplasmático de los receptores de glicina y GABAa son críticos para modulación por Gβy y etanol.
(Universidad de Concepción., 2012) Castro Maldonado, Patricio Alejandro; Aguayo Hernández, Luis Gerardo
El etanol es una de las drogas de abuso mas ampliamente utilizadas a nivel mundial generando cuantiosas pérdidas de dinero así como de vidas humanas debido a su consumo. ¿Cómo el etanol, a concentraciones fisiológicamente relevantes (< 100 mM), es capaz de producir sus efectos tanto a nivel sistémico como a nivel celular? y ¿cuáles son los determinantes para que estos efectos se produzcan? son aún desconocidos. Se ha descrito que esta droga modula a los receptores de glicina (R-Gli), GABAA (R-GABAA), GABAC (R-GABAC), serotonina tipo 3 (5-HT3) y nicotínicos de acetilcolina (R-nACh), los cuales pertenecen a la superfamilia de los canales iónicos activados por ligando (Cys-loop LGICs). Estudios realizados en animales han demostrado una importante participación de los receptores de R-Gli y RGABAA en algunos efectos sistémicos como la inducción de sueño, lo que da relevancia a su estudio, así como su participación en importantes funciones fisiológicas que van desde el control motor hasta la generación de complejas funciones cognitivas. Proteínas intracelulares también han sido vinculadas a los efectos del etanol, dentro de las cuales encontramos a las adenilil ciclasas (AC), la proteína quinisa A (PKA), la proteína quinasa C (PKC), la fosfolipasa C (PLC) y recientemente a proteínas G. Estos dos blancos para la acción del etanol (receptores y proteínas intracelulares) han sustentado la generación de dos hipótesis que han tratado de explicar los efectos de esta droga a nivel celular. La primera de ellas se refiere a la acción directa del etanol en los receptores tipo canales iónicos, mientras que la segunda hipótesis contempla una modulación indirecta de estos receptores a través de proteínas efectoras intracelulares, las cuales serían en primera instancia el blanco del etanol. La modulación del R-Gli por etanol ha sido ampliamente descrita y aceptada, a diferencia del R-GABAA, donde los numerosos estudios realizados no han logrado establecer un mecanismo de acción común. En el R-Gli se han identificado residuos claves de carácter básico (316-320, 385-386) presentes en el ICD, los cuales serían cruciales para que esta modulación se lleve a cabo. A su vez, la activación de Gβγ es crítica para la sensibilidad al etanol en este receptor. En el RGABAA existen sub-unidades que poseen agrupaciones de aminoácidos básicos homólogos a los encontrados en la sub-unidad α1 del R-Gli en su dominio intracelular, lo cual permite postular un mecanismo similar de modulación al encontrado en el R-Gli. Por lo anterior es que nos propusimos estudiar si residuos básicos presentes en los dominios intracelulares de los R-Gli y R-GABAA participan en la interacción y modulación efectuada por Gβγ y etanol. Para evaluar esta hipótesis realizamos experimentos de sobrexpresión de la subunidad α1 del R-Gli WT y mutantes del residuo 385K con aminoácidos con diferentes propiedades fisicoquímicas, encontrando que solo aminoácidos básicos (K y R) mantienen la sensibilidad a etanol no alterándose la sensibilidad a otros moduladores como neuroesteroides o anestésicos generales como α-xalona y propofol respectivamente, donde todas las mutantes se expresan y comportan farmacológicamente similares al receptor WT. Para el caso del R-GABAA, evaluamos la asociación de algunas de sus subunidades con Gβγ, encontrando un patrón gradual de unión, donde la subunidad α1 une Gβγ en forma similar a α1 del R-Gli; las subunidades γ2 y α6 lo hacen en menor grado, mientras que α4 no presenta unión. Posteriormente, decidimos construir una proteína quimérica entre las subunidades α1 del R-Gli y la subunidad γ2 del R-GABAA, lo cual identificó a 2 regiones importantes para la modulación por etanol en este receptor. Una de ellas comprende al dominio TM4, que tendría implicancia en el gating del canal, mientras la segunda ubicada en el dominio N-terminal del IL entre los residuos 309 y 313 sería importante para preservar una estructura α-hélice de la región. Finalmente, la posición homóloga a 385K en el R-Gli (408 en el receptor quimérico) es fundamental para reestablecer el efecto de etanol en el receptor α1-γ2. Todos estos hallazgos demuestran que la presencia de: i) un gating energéticamente favorable, ii) una estructura α-hélice en la región N-terminal de IL y iii) un residuo básico en la posición homóloga 385 del R-Gli son fundamentales para conferir sensibilidad a etanol en este receptor. En conclusión, podemos decir que el carácter básico del residuo 385 es crucial para la sensibilidad a etanol en α1 R-Gli, mientras el R-GABAA posee subunidades capaces de interaccionar con Gβγ en forma similar a α1 R-Gli, lo cual podría revelar un mecanismo de modulación similar para ambos receptores.
Regulación de receptores de glicina por sistemas de transducción de señales acoplados a proteínas G. papel de las proteínas G en la potenciación del receptor de glicina por etanol.
(Universidad de Concepción., 2007) Yévenes Crisóstomo, Gonzalo Enrique; Aguayo Hernández, Luis Gerardo
El receptor de glicina es un miembro de la superfamilia de canales iónicos activados por ligando y posee un rol importante en la regulación de la excitabilidad neuronal en la medula espinal y bulbo raquídeo de mamíferos. La función del R-Gli puede ser modulada por ligandos exógenos de diferentes naturalezas químicas, como por ejemplo, el alcaloide estricnina, iones zinc,anestésicos generales y etanol. Por otra parte, la actividad del receptor también puede ser regulada intracelularmente, a través de proteínas quinasas y mediante modulación directa por el heterodímero Gβγ. En este contexto, es de una particular importancia para nuestro laboratorio caracterizar los determinantes moleculares involucrados en la modulación mediada por Gβγ presentes en el segmento citosólico, lo que permitirá además examinar el rol de las proteínas G en la sensibilidad del receptor a etanol. El presente trabajo utilizó como estrategia principal la expresión de subunidades α R-Gli silvestres,quiméricas y mutadas en células HEK 293, para posteriormente analizar la modulación mediada por Gβγ y etanol mediante electrofisiología. Estudios funcionales de α1 R-Gli delecionados y mutados en la región intracelular permitieron determinar que dos secuencias de carácter básico (316RFRRK y 385KK) posicionadas en ambos extremos del segmento intracelular son claves para la modulación de la subunidad α1 del R-Gli humano por Gβγ. Por otro lado, estudiando las propiedades fisiológicas de estos R-Gli se pudo deducir que la región intracelular entre el TM3 y el TM4 es también importante en la determinación de algunas propiedades funcionales del receptor, como por ejemplo, sensibilidad a glicina y desensibilización. En particular, el reemplazo por alaninas de la secuencia 316RFRRK afectó profundamente la sensibilidad del receptor a glicina y su desensibilización independientemente del sitio extracelular de unión a ligando, lo que sugiere un rol importante de esta secuencia para la correcta función del canal iónico en eventos posteriores de la unión del agonista. Al estudiar la regulación de R-Gli silvestres y quiméricos de la subunidad α1 y α2 por Gβγ se pudo determinar que la modulación funcional positiva de Gβγ en α1 R-Gli no dependería exclusivamente de la unión del heterodímero al receptor, ya que la sustitución de los únicos dos residuos no conservados (G254 y S296) entre las regiones de transmembrana de la subunidad α1 y α2 alteró significativamente la modulación funcional positiva de Gβγ sin alterar los sitios intracelulares de aminoácidos básicos. De este modo, los resultados obtenidos y otros datos generados dentro de nuestro laboratorio permitieron proponer un modelo para la regulación funcional del α1 R-Gli por Gβγ, el cual se compone de una primera etapa de unión del heterodímero a la región intracelular de α1 R-Gli a través de las secuencias de residuos básicos, y de una segunda etapa de cambios conformacionales de los dominios de transmembrana del receptor provocados por la unión de Gβγ, lo que finalmente produce una conformación del canal iónico con una mayor probabilidad de apertura en presencia de glicina. Utilizando estrategias similares, se examinó el rol de la región intracelular del R-Gli y de la regulación mediada por Gβγ en los efectos de etanol. Los resultados de esta tesis demostraron que la potenciación de la corriente activada por glicina producida por concentraciones farmacológicas de etanol sería un fenómeno mayoritariamente indirecto, dependiente de la señalización intracelular mediada por el heterodímero Gβγ. Esta conclusión se encuentra principalmente sostenida en base a la caracterización de los R-Gli mutados, los cuales mostraron que el efecto de etanol fue atenuado específicamente por mutaciones intracelulares asociadas a la regulación por Gβγ de α1 R-Gli, con una correlación positiva entre la sensibilidad a etanol de cada mutante y su grado de modulación por Gβγ. Coincidentemente, la potenciación inducida por etanol en α1 R-Gli silvestres fue atenuada específicamente mediante la sobreexpresión de proteínas que unen Gβγ con alta afinidad, lo que indica un requerimiento de subunidades Gβγ libres para el efecto de etanol en el receptor. En conjunto, las evidencias presentadas en este trabajo de tesis describen por primera vez regiones en el R-Gli que son reguladas por Gβγ, lo que contribuye al conocimiento del rol de los segmentos intracelulares para la correcta estructura, localización, función y regulación de todos los miembros de la superfamilia LGIC. Además, se describen por primera vez la existencia de sitios intracelulares específicos para los efectos de etanol en el R-Gli y también se demuestra un rol clave de la señalización mediada por Gβγ en el mecanismo de acción de etanol. En conclusión, los resultados de este estudio permiten proponer una hipótesis nueva acerca de la regulación de la superfamilia LGIC por etanol, y además, enriquecen el conocimiento acerca de los mecanismos mediante los cuales el alcohol afecta el sistema nervioso humano.
The importance of glycine receptor clustering in the functional maturation of spinal synapses.
(Universidad de Concepción., 2002) Zundert, Brigitte van; Aguayo Hernández, Luis Gerardo
Considerando abundantes estudios bioquímicos e inmunocitoquímicos se ha generado un modelo que describe la estructura de la sinápsis glicinérgica en neuronas espinales. Así, se postula que el citoesqueleto, a través la proteína periférica geferina, ancla el receptor de glicina (R-Gli) a sitios específicos de la membrana post-sináptica. Al mismo tiempo que el R-Gli forma estas agrupaciones, la transmisión sináptica inhibitoria espontánea (mIPSC) aumenta. Además, varias de las propiedades fisiológicas de la corriente activada por glicina (Iglicina) son modificadas, incluyendo su sensibilidad a glicina y su regulación por proteína G. A través de la técnica ´whole-cell patch-clamp´ y mediante análisis de microscopía confocal, hemos estudiado sí el agrupamiento de los R-Gli en la membrana postsináptica por geferina y el citoesqueleto regula los cambios fisiológicos del receptor durante el desarrollo de la médula espinal. Uno de los principales resultados de este tesis es que los microtúbulos regulan la función y estructura de las agrupaciones sinápticas del R-Gli en una forma dependiente del estado del desarrollo. Así, se encontró que la aplicación aguda de colchicina disminuía significativamente la amplitud de mIPSC glicinérgicas (30%) en neuronas inmaduras (5-7 DIV), mientras que no tenía efectos sobre neuronas maduras (15-17 DIV). Análisis cinéticos y el bloqueo de mIPSC glicinérgicas con picrotoxina, reveló la presencia de la forma 2 neonatal (eventos lentos) y 1 adulta (eventos rápidos) del R-Gli. La depolimerización de microtúbulos afectó preferencialmente a receptores 2 sinápticos. Luego de la maduración sináptica se encontró que principalmente la forma adulta del R-Gli permanecía en la membrana postsináptica y que el tratamiento con colchicina no fue efectivo en este estado. En forma similar a lo observado para microtúbulos, encontramos que citocalasina-D producía alteraciones en las propiedades fisiológicas de la transmisión glicinérgica, que dependía del grado de maduración de las neuronas espinales, modificando los R-Gli postsinápticos sólo en células inmaduras. La aplicación intracélular de citocalasina-D y latrunculina-A en neuronas inmaduras, aumentó significativamente (190%) la frecuencia de las mIPSC glicinérgicas, sin variar la amplitud de los eventos. Aunque ambas drogas son membrana permeable, la aplicación extracélular de citocalasina-D y latrunculina-A resultó en una importante reducción de la transmisión sináptica total y glicinérgica. Estos resultados indican que los filamentos pre y postsinápticos están involucrados en el mantenimiento de la transmisión glicinérgica en neuronas espinales inmaduras Con el objetivo de bloquear la formación de agrupaciones de R-Gli sin alterar el citoesqueleto, cultivos de neuronas espinales fueron tratados con un oligonucleótido antisentido para geferina. Este tratamiento resultó en la pérdida de las agrupaciones de R-Gli sinápticas lo cual se correlacionó con una reducción casi completa en la transmisión glicinérgica. Sin embargo, el tratamiento tanto con el oligonucleótido antisentido, como con las drogas depolimerizantes del citoesqueleto (utilizados en forma aguda y crónica), fueron incapaces de alterar el ´´rundown´´ de las corrientes evocadas por glicina o la sensibilidad de la Iglicina a glicina, estricnina o picrotoxina. Al cuantificar el conjunto de los resultados obtenidos, nos permite estimar que gran parte (~65%) de la Iglicina se debe a la activación de los receptores extrasinápticos y por lo tanto concluimos que la farmacología y la estabilidad funcional de los R-Gli extrasinápticos no dependen de una interacción con geferina y el citoesqueleto. Finalmente, analizamos si existía un ´´cross-talk´´ entre el R-Gli y proteínas G en la membrana postsináptica. Fue así como encontramos que en células tratados con el oligonucleótido antisentido para geferina, la aplicación de GTP--S a través de la pipeta de patch no fue capaz de potenciar a Iglicina. Por otro lado, estudios de transmisión glicinérgica revelaron que GTP--S producía un aumento de dos veces en la constante de decaimiento de los eventos rápidos (1), pero no de los eventos lentos (2). En conjunto, estos resultados sugieren que existiría un cross-talk entre un receptor asociados a proteínas G (GPCR) y el R-Gli 1 postsináptico, interacción que se ve favorecida durante desarrollo. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis indican que dependiendo del estado de maduración de las neuronas y de la expresión de las diferentes subunidades de R-Gli, la organización de los microtúbulos y microfilamentos regula la transmisión glicinérgica en neuronas de médula espinal. Además, nuestros estudios nos permiten postular que la interacción del R-Gli con geferina y el citoesqueleto no sólo facilita el anclaje de los receptores frente a los terminales presinápticos, sino que también posibilita la formación de microdominios con otras moléculas involucradas en la transducción de señales, incluyendo receptores metabotrópicos.

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Browsing Tesis Doctorado by Author "Aguayo Hernández, Luis Gerardo"

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